反相高效液相色谱法测定瘤胃液中的生物胺

王东升 霍文婕 朱伟云 毛胜勇

(南京农业大学动物科技学院，南京 210095)

生物胺(biogenic amine，BA)是脂肪族、芳香族或杂环族的低分子质量有机碱，常存在于动植体内及食品中［1］。反刍动物瘤胃液中的生物胺主要是由瘤胃液中相关微生物产生的酶或饲料原料中固有的酶催化瘤胃液中游离氨基酸脱羧基生成［2］。正常状态下，瘤胃液中生物胺浓度很低，但当动物摄入的蛋白质或可发酵碳水化合物大量增加时，瘤胃液中的生物胺浓度会增加，进而致宿主出现一系列疾病，如蹄叶炎等［3］。因此，建立瘤胃液中生物胺的检测方法，对于了解瘤胃内生物胺的生成规律具有重要意义。

尽管目前已有多种方法应用于食品生物胺的测定，如:薄层色谱(TLC)、毛细管电泳(cE)、气相色谱(GC)以及基于生物传感器的方法等［1，4］，但有关瘤胃液中生物胺的检测方法的报道很少，并且多为仅针对于某一类生物胺，如组胺或色胺等。实际上，瘤胃液中还可能存在腐胺、尸胺等源于氨基酸的异常代谢产物，而这些物质也会对宿主健康带来危害［3］。由此，为进一步了解瘤胃内生物胺的生成规律，本试验采用反相高效液相色谱法，建立瘤胃液生物胺的测定方法，拟为深入探讨瘤胃内氨基酸的代谢及生物胺的生成规律奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂和样品

色胺(tryptamine，TRY)、腐 胺(putrescine，PUT)、甲胺(methylamine，MET)、组胺(histamine，HIS)、酪胺(tyramine，TYR)、丹磺酰氯(dansyl chloride)均购自Sigma公司。乙腈、乙酸铵和丙酮为色谱纯;盐酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、冰乙酸为分析纯;超纯水(Milli-Q，Millipore公司)在实验室制备。瘤胃液采自饲喂精粗比为1∶9和7∶3的6头长江三角洲白山羊(雄性)，饲粮精饲料由70%玉米和30%豆粕组成，粗饲料由70%苜蓿和30%羊草组成。

1.2 试验方法

1.2.1 标准储备液及标准溶液的配制

准确称取色胺 16.0 mg、腐胺 16.1 mg、组胺11.1 mg、酪 胺 13.7 mg、甲胺 6.75 mg，用0.5 mol/L的盐酸定容至10 mL，制成10 mol/L储备液备用。分别取以上标准品储备液，用0.5 mol/L盐酸配制成终浓度分别为10、100、1 000 μmol/L的标准溶液，采用铝箔纸避光、-25℃保存。

1.2.2 样品处理

取 100 μL 待测样品加入150 μL 的0.5 mol/L的盐酸，涡旋混匀后4℃下13 000 r/min离心10 min，沉淀部分如上述方法再提取1次。取2次的上清液用0.5 mol/L的盐酸定容到10 mL。

1.2.3 标准溶液及样品的衍生化

分别取上述的生物胺标准溶液及样品溶液200 μL，加入 100 μL 的饱和碳酸氢钠溶液(用氢氧化钠调节pH=11)进行缓冲，再加入100 μL的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(10 g/L，丙酮为溶剂)，然后置于60℃水浴中、黑暗条件下反应20 min。反应结束后加入100 μL的1%冰乙酸。衍生处理后，4℃下13 000 r/min离心10 min后取上清液待测［5］。

1.2.4 仪器设备

岛津液相色谱系统(LC-10ATVP)。

1.2.5 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX 80A Extend-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流速为1 mL/min，紫外检测器波长为 260 nm，进样量20 μL，柱温30℃，流动相A为乙腈，流动相B为乙酸铵溶液，采用梯度洗脱，程序见表1。

1.2.6 加标回收率试验

取新鲜样品，按照1.2.2方法处理样品，取200 μL样品加入5种生物胺标准溶液，使之相当于各添加125和250 μmol/L的浓度，3次重复试验，扣除样品中空白试验生物胺的浓度，求得其回收率。

1.2.7 不同精粗比饲粮对山羊瘤胃液中生物胺浓度的影响

受试动物为6头装有永久性瘤胃瘘管、体况良好的雄性长江三角洲白山羊，单栏饲喂，自由饮水。受试动物随机分为2组，分别饲喂精粗比为1∶9(日饲喂精饲料 100 g，粗饲料900 g)和 7∶3(日饲喂精饲料700 g，粗饲料300 g)的饲粮。精饲料和粗饲料组成与1.1中相同。于08:00和20:00分2次等量饲喂。

适应饲粮 18 d后，于第 19、20、21天饲喂(08:00)前采集瘤胃液，用于初步研究2种饲粮精粗比条件下饲喂前瘤胃液中5种生物胺的差异。

表1 梯度洗脱程序Table 1 The gradient elution procedures

1.3 统计分析

数据采用独立t检验进行统计分析，显著性水平置于 0.05。

2 结果与分析

2.1 保留时间

本试验采用乙腈和水为流动相，并采用表1所示的梯度程序洗脱。在使用单标确定保留时间(表2)的基础上，将5种单标混合，取混合的混标进行色谱分离，由图1、图2可见，5种胺在40 min内能得到很好分离，且峰形对称，没有拖尾等现象。

表2 5种生物胺的保留时间Table 2 Retention time of the five biogenic amines

2.2 标准曲线及检测限

将标准溶液依次以10、100和1 000 μmol/L进样，所得峰面积对相应的标准溶液浓度做标准曲线，并计算标准曲线的回归方程及相关系数，结果见表3。本方法的检出限是以信噪比(S/N)大于3作为判断标准，色胺的检测限为10.0 μmol/L，甲胺的检测限为 1.2 μmol/L，其余3 种胺的检测限都为 1.0 μmol/L。

图1 生物胺混标色谱图Fig.1 Chromatogram of a mixed standard solution of biogenic amine

图2 瘤胃液生物胺色谱图Fig.2 Chromatogram of biogenic amine in rumen liquid

2.3 回收率测定

由表4可知，5种生物胺的平均回收率如下:酪胺 94.97%、腐胺 95.54%、组胺 93.48%、甲胺92.90%、色胺 93.00%，相对标准偏差均低于10%，可见该方法可满足检测的需要。

2.4 饲粮精粗比对瘤胃液5种生物胺的影响

由表5可见，在2种饲粮精粗比条件下，高精料瘤胃液中酪胺与甲胺浓度均显著高于低精料组(P＜0.05)，但二者间在腐胺、组胺及色胺浓度上无显著性差异(P＞0.05)。

表3 生物胺的回归方程、相关系数及检测限Table 3 Regression equation，correlation coefficient square and the detectability of biogenic amine

表4 本试验方法的回收率Table 4 Average recovery of the method in the present study

表5 饲粮精粗比对瘤胃液中5种生物胺浓度的影响Table 5 Effects of dietary forage-to-concentrate ratio on concentrations of the five biogenic amines in rumen liquid μmol/L

3 讨论

生物胺是一类含氮低分子化合物，对动植物和微生物有重要的生理作用。适量的生物胺有助于动物机体正常的生理功能，过量则会引起不良生理反应。目前国内外有关瘤胃内生物胺的检测主要采用液相色谱法，一般仅针对组胺［6］。实际上瘤胃中还含有其他的生物胺(腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、尸胺、甲胺等)，且其存在会对组胺的毒性有协同作用［3，8-9］。因此，多组分生物胺的同时检测对于了解瘤胃微生物对氨基酸的代谢以及研究瘤胃健康具有重要生物学意义。

本试验结果表明，采用丹磺酰氯柱前衍生方法，应用紫外检测器能够满足分析检测瘤胃液中生物胺的需求，瘤胃液中色胺、腐胺、甲胺、组胺、酪胺5种生物胺能在40 min内得到很好分离。除了酪胺外，其他生物胺的线性范围为10～1 000 μmol/L(R2＞0.99)，该方法的平均回收率分别为色胺 93.00%、腐 胺 95.54%、甲 胺92.90%、组胺 93.48%、酪胺 94.47%，相对标准偏差小于10%。结果说明采用该方法可用于分析瘤胃液中的生物胺，同时分离效果好，完全满足瘤胃液中生物胺的检测需要。

由于我国粗饲料资源相对有限，而生产者过度追求经济效益，在奶牛生产中使用了大量的精饲料，虽其结果会提高奶牛的产奶性能，但奶牛的消化代谢疾病明显增多，使用寿命大大缩短，给畜牧生产造成重大经济损失［10］。相关报道表明，奶牛饲粮中精饲料比例过高时，奶牛瘤胃内常发生急性酸中毒，瘤胃内乳酸累积，进而引起酸中毒而死亡，而在慢性酸中毒情况下，瘤胃内异常代谢产物如组胺和内毒素等均会大量增加，使奶牛继发其他疾病［11-13］。本试验结果显示，高精料饲粮条件下，山羊瘤胃液中酪胺和甲胺浓度远高于低精料饲粮，提示饲粮精粗比对瘤胃内生物胺的浓度具有较明显的影响。但本试验中，笔者未发现饲粮精粗比对瘤胃液中组胺、色胺和腐胺浓度的影响，可能与采样的时间点有关系，本试验仅初步研究了饲喂前瘤胃液中5种生物胺的差异，而饲喂后瘤胃内5种生物胺是如何变化的?饲粮精粗比对这5种生物胺浓度有何影响?目前尚不清楚，需进一步研究。

4 结论

①本试验建立了反相高效液相色谱法测定瘤胃液中的5种生物胺的方法。

②饲粮精粗比可影响瘤胃液中生物胺浓度，高精料饲粮条件下瘤胃液中酪胺和甲胺浓度显著增加。

［1］蔡成岗，张慧，王智敏，等.食品中生物胺及其检测方法研究进展［J］.食品研究与开发，2009(10):153-156.

［2］WIEBKE E，ANNETTE Z，KLAUS D，et al.LC analysis of histamine and other biogenic amines in digesta cultures［J］. Chromatographia，2009，70:1207-1213.

［3］NAGARAJA T G，TITGEMEYER E C.Ruminal acidosis in beef cattle:the current microbiological and nutritional outlook［J］.Journal of Dairy Science，2007，90:17-38.

［4］范春艳，孔维府，潘秋红，等.葡萄酒中8种生物胺的RP-HPLC检测方法的研究［J］.中国酿造，2010(11):168-171.

［5］屠春燕，袁艳娟，吴燕娇，等.对甲氧基苯磺酰氯柱前衍生生物胺的高效液相色谱分离［J］.分析试验室，2010(3):96-100.

［6］PILACHAIR，SCHONEWILLEJT，THAMRONGYOSWITTAYAKUL C，et al.The effects of high levels of rumen degradable protein on rumen pH and histamine concentrations in dairy cows［J］.Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，doi:10.1111/j.1439-0396.2011.01139.x.

［7］DAIN J A，NEAL A，DOUGHERTY R W.The occurrence of histamine and tyramine in rumen ingesta of experimentally overfed sheep［J］.Journal of Animal Science，1955，14:930-935.

［8］IRWIN L N，MITCHELL G E，Jr.，TUCKER R E，et al.Occurence and disappearance of ruminal histamine and tyramine［J］.Journal of Animal Science，1979，48(6):1470-1474.

［9］ASCHENBACH J R，GÄBEL G.Effect and absorption of histamine in sheep rumen:significance of acidotic epithelial damage［J］.Journal of Animal Science，2000，78(2):464-470.

［10］胡红莲，卢德勋，刘大程，等.日粮不同NFC/NDF比对奶山羊瘤胃pH、挥发性脂肪酸及乳酸含量的影响［J］.动物营养学报，2010，22(3):595-601.

［11］KRAUSE K M，OETZEL G R.Understanding and preventing subacute ruminal acidosis in dairy herds:a review［J］.Animal Feed Science and Technology，2006，126:215-236.

［12］KHAFIPOUR E，KRAUSE D O，PLAIZIER J C.A grain-based subacute ruminal acidosis challenge causes translocation of lipopolysaccharide and triggers inflammation［J］.Journal of Dairy Science，2009，92(3):1060-1070.

［13］KHAFIPOUR E，KRAUSE D O，PLAIZIER J C.Alfalfa pellet-induced subacute ruminal acidosis in dairy cows increases bacterial endotoxin in the rumen without causing inflammation［J］.Journal of Dairy Science，2009，92(4):1712-1724.