海南霉素对体外瘤胃微生物发酵和氮代谢的影响

王志博 张永根辛杭书 刘 薇 夏 科

(东北农业大学动物科技学院，哈尔滨 150030)

长期以来，营养学家一直试图通过瘤胃的调控来提高饲粮能量和蛋白质的利用效率，主要手段是通过控制瘤胃代谢酸中毒和瘤胃pH，增加十二指肠非降解饲料蛋白质及微生物蛋白质的流量，降低甲烷的排放和提供更多的葡萄糖及挥发性脂肪酸(VFA)，从而提高能量供应。在反刍动物的饲粮中添加离子载体可以达到上述目的。研究表明，作为离子载体的莫能菌素能够降低氨的产生量并增加瘤胃蛋白质的流量［1－3］，短期的体外瘤胃液培养表明莫能菌素能够抑制蛋白质降解为氨［4］。

海南霉素(hainanmycin)是近年我国自行研制的聚醚类离子载体抗生素，其基本作用机理是通过改变敏感微生物细胞膜对离子的通透性，导致细菌能量代谢改变，从而影响微生物的代谢和生长。生产中使用的海南霉素为1%或10%海南霉素钠预混剂，商品名为“球克”或“鸡球素”，其外观为黄色粉末［5］。近年来，海南霉素对反刍动物的影响已有一些文献报道，其能够降低瘤胃内乙酸与丙酸比例及氨态氮(NH3-N)浓度［6－7］。沈赞明等［8］报道海南霉素能够增加瘤胃肽浓度，具有节约蛋白质的作用。但是，上述研究并未从海南霉素对瘤胃微生物影响的角度来揭示海南霉素对氮代谢影响的深层原因。因此，本试验采用短期体外培养法，一方面验证海南霉素对瘤胃发酵的影响，另一方面从参与蛋白质分解的主要瘤胃微生物数量变化为出发点来分析肽、氨基酸、蛋白酶和脱氨酶的相关变化，从而揭示海南霉素对瘤胃氮代谢调控的机理，并以此作为海南霉素应用在反刍动物生产中的试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

海南霉素:纯度≥90%(山东胜利股份有限公司);莫能菌素:纯度≥90%(美国礼来公司)。

1.2 试验设计

试验共分6组，采用单因素试验设计。第1组为对照组(CON)，按照正常的体外培养方法进行培养，不添加任何离子载体;第2组为10 mg/L莫能菌素组(MON，阳性对照);第3～6组分别为0.1、1.0、10.0 和 100.0 mg/L 海南霉素组(H0.1、H1.0、H10.0 和 H100.0)。每组设 3 个重复，体外培养在不同天内重复2次。

1.3 体外培养

供采集瘤胃液的试验奶牛的饲粮(粗蛋白质18%，中性洗涤纤维30%，酸性洗涤纤维22%)精粗比为40∶60，饲粮(干物质基础)组成为60.3%的苜蓿、17.2% 的玉米粉、12.2% 的大麦粉、9.7%的大豆粉和0.6%的维生素与矿物质预混剂。每kg维生素和矿物质预混剂含有(干物质基础):7 mg Co，167 mg Cu，33 mg I，2 660 mg Mn，27 mg Se，4 660 mg Zn，1 000 000 IU VA，200 000 IU VD3，1 330 mg VE，267 g 尿素，67 g NaCl，33 g S和300 g MgO。此饲粮按照NRC(2001)奶牛营养需要进行配制。体外培养底物的精粗比为40∶60，除了不含上述饲粮的预混剂外，其组成与上述奶牛饲粮相同。

体外培养参照Tilley等［9］所述的方法进行。采集3头装有永久瘤胃瘘管的泌乳期的中国荷斯坦奶牛(饲喂上述饲粮)的瘤胃液，2层纱布过滤，再与碳酸钠缓冲液1∶1混合，作为培养缓冲液［10］。以100 mL的玻璃注射器为培养管，每管内加入50 mL缓冲液和0.5 g上述培养底物。在用橡胶塞密封前，通过放气阀向每个培养管通入CO2。将4个不同剂量的海南霉素分别溶解于乙醇中，然后取0.2 mL添加到各自培养管中。将莫能菌素也溶解于乙醇中，同样取0.2 mL添加到培养管中。取0.2 mL的乙醇(未溶解离子载体)添加到对照组培养管中。在水浴条件下培养，培养温度为39℃。

1.4 测定项目与方法

培养24 h后，立即测定pH。然后收集样品用于VFA、NH3-N、肽、氨基酸、蛋白酶、脱氨酶的测定及DNA的提取。

VFA浓度采用日本岛津GC－2010气相色谱测定［11］，NH3-N 浓度采用 Broderick 等［12］所述的次氯酸钠－苯酚法(UV－VIS8500型分光光度计，上海天美科学仪器有限公司)测定，肽和氨基酸浓度采用茚三酮显色法测定［13］;蛋白酶和脱氨酶活性参照Siddons等［14］的方法测定，其中脱氨酶活性定义为每小时每毫升酶液释放1 mg NH3-N的酶量为1个酶活单位，而蛋白酶活性定义为每小时每毫升酶液释放1 mg非蛋白氮的酶量为1个酶活单位。

DNA的提取、PCR引物和PCR扩增按照Stevenson等［15］的方法进行。本试验采用相对定量的方法对目的菌数量进行测定，其具体的方法是将目的菌和总细菌PCR扩增的Ct值进行log10转换，然后将目的菌转换后的值与总细菌转换后的值进行比较，即目的菌基因拷贝数占总细菌基因拷贝数的百分比(相对拷贝数，RPS，%)。PCR定量的微生物包括:总普雷沃氏菌(genus Prevotella)、栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)、短普雷沃氏菌(Prevotella brevis)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolven)、反刍兽新月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、埃氏巨球型菌(Megasphaera elsdenii)和嗜淀粉瘤胃杆菌(Ruminobacter amylophilus)。

1.5 数据处理

用SAS 8.1统计软件中的MIXED模型进行统计分析，体外培养不同的2天作为随机效应。对照组和离子载体组间的差异采用Duncan氏法进行多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 海南霉素对体外培养瘤胃微生物发酵的影响

海南霉素对体外培养瘤胃pH和VFA浓度的影响见表1。与CON相比，仅H100.0降低了总VFA浓度并提高了pH(P＜0.05);MON对pH和总VFA浓度没有显著影响(P ＞0.05)。H10.0、H100.0 和MON的乙酸、丁酸浓度显著低于CON(P＜0.05)。与CON 相比，H10.0、H100.0和 MON 显著降低了乙酸与丙酸比，并显著提高了丙酸浓度(P＜0.05)。而H0.1 和H1.0对以上指标均无显著影响(P ＞0.05)。

表1 海南霉素对体外培养瘤胃pH和VFA浓度的影响Table 1 Effects of hainanmycin on rumen pH and VFA concentration in vitro

2.2 海南霉素对体外培养氮代谢的影响

表2的结果表明，除了H0.1，其他海南霉素组NH3-N和氨基酸浓度显著高于CON(P＜0.05)，MON也得到同样的结果。与 CON相比，H10.0、H100.0和 MON 显著提高了肽浓度(P ＜0.05)，H0.1、H1.0 对肽浓度没有显著影响(P ＞ 0.05)。H0.1和H1.0对蛋白酶和脱氨酶活性没有显著影响(P ＞0.05)，而 H10.0、H100.0 和 MON 显著提高了蛋白酶活性且显著降低了脱氨酶活性(P＜0.05)。

表2 海南霉素对体外培养NH3-N、肽和氨基酸浓度及蛋白酶和脱氨酶活性的影响Table 2 Effects of hainanmycin on concentrations of NH3-N，peptide and amino acids，and activities of protease and deaminase in vitro

2.3 海南霉素对体外瘤胃微生物蛋白质分解菌的影响

表3列出了体外培养后主要参与氮代谢的微生物的RPS。与CON比，除H0.1外，其他海南霉素组显著降低了原虫的RPS(P＜0.05);MON也显著降低了原虫的 RPS(P＜0.05)。H10.0和H100.0短普雷沃氏菌和总普雷沃氏菌群的RPS显著高于CON(P＜0.05)，而其他海南霉素组对短普雷沃氏菌和总普雷沃氏菌群的RPS没有显著影响(P ＞0.05)。H10.0、H100.0和 MON 的栖瘤胃普雷沃氏菌的RPS显著高于CON(P＜0.05)。MON和所有海南霉素组对反刍兽新月形单胞菌、埃氏巨球型菌、嗜淀粉瘤胃杆菌的RPS没有显著影响(P ＞0.05)。除H0.1和 H1.0 外，其他海南霉素组和MON的溶纤维丁酸弧菌的RPS显著低于CON(P ＜0.05)。

表3 海南霉素对体外培养参与氮代谢的主要微生物的RPS的影响Table 3 Effects of hainanmycin on RPS of primary microorganisms participating in nitrogen metabolism in vitro %

3 讨论

3.1 海南霉素对体外培养瘤胃微生物发酵的影响

MON显著降低了乙酸、丁酸浓度以及乙酸与丙酸比，显著提高了丙酸浓度，对总VFA浓度没有显著影响，这些结果与以前的体内和体外的研究结果一致［16－18］，这些研究结果发现添加莫能菌素维持总VFA浓度不变，提高丙酸浓度，降低乙酸、丁酸浓度。H10.0和H100.0高浓度的海南霉素影响了瘤胃微生物发酵，而低浓度的海南霉素对瘤胃微生物发酵没有显著影响，这表明海南霉素对瘤胃微生物发酵的影响与剂量有关。

H10.0和H100.0对瘤胃微生物发酵的影响与MON相似，这样的结果与已知的海南霉素具有抗生素的活性相一致，与之前海南霉素对瘤胃发酵的影响的研究结果相似［6］。然而，H100.0使得总VFA浓度降低，对瘤胃微生物发酵有负面影响，因此对其不做进一步讨论。H10.0对瘤胃微生物发酵模式的影响与MON对瘤胃微生物发酵模式的影响没有差别，这表明海南霉素对瘤胃发酵的作用模式与莫能菌素对瘤胃发酵的作用模式相似。

3.2 海南霉素对体外培养氮代谢的影响及其机理

本试验结果表明，H10.0和H100.0的原虫数量很少，这2组的总普雷沃氏菌群和栖瘤胃普雷沃氏菌的相对数量比CON多，目前还未见海南霉素对上述2种菌数量影响的研究报道。但Weimer等［19］对莫能菌素的研究发现，添加莫能菌素后上述2种菌的相对数量增加，与本试验的结果一致。而海南霉素对其他几种参与氮代谢的细菌未产生显著影响。

从本试验结果来看，海南霉素可以减少瘤胃液中的 NH3-N浓度，这与李炯明等［7］和沈向真等［20］报道的海南霉素对NH3-N浓度的影响的结果是一致的。脱氨酶主要是由一些蛋白质降解微生物产生的，其能够对氨基酸进行脱氨基，从而释放出NH3-N。本试验结果表明，较高浓度海南霉素显著降低了脱氨酶活性。Ives等［21］向奶牛饲粮中添加离子载体，也得到了瘤胃液中脱氨酶活性降低的结果。有研究表明，体外培养条件下，添加离子载体能够降低脱氨酶活性［22］。纤毛虫具有较强的脱氨基作用，大多数纤毛虫能利用蛋白质和氨基酸产生氨。一般而言，混合纤毛虫的这种特殊活性是细菌的3倍［23］，在去瘤胃原虫的情况下，瘤胃液的脱氨基活性降低，NH3-N浓度降低［24］。Jouany［25］研究表明，去原虫的绵羊的瘤胃 NH3-N浓度比接种原虫的绵羊的瘤胃NH3-N浓度低。本试验的NH3-N浓度也降低了，虽然本试验没有去原虫，但是添加海南霉素使纤毛虫数量降至很低，相当于去原虫，因此这可能是NH3-N浓度降低的原因。

瘤胃中数量最多的蛋白质降解菌是普雷沃氏菌属(Prevotella)的细菌，在饲喂精粗比不同的饲粮时，该属的蛋白质降解菌株一直存在，其总数可能占瘤胃细菌总数的60%，且具有很强的蛋白酶活性。本试验发现海南霉素能够提高瘤胃蛋白酶活性。由于普雷沃氏菌属细菌数量增加，从而有更多的这种细菌分泌蛋白酶，因此蛋白酶活性提高。

研究发现，给奶牛饲喂莫能菌素降低了肽和氨基酸在瘤胃的消失速率［17］。Zinn 等［26］报道，添加莫能菌素有更多的饲料氮逃脱瘤胃降解。沈赞明等［8］的研究表明，向山羊瘤胃中灌注海南霉素可提高瘤胃中可溶性蛋白和肽浓度。本试验中海南霉素提高了瘤胃肽和氨基酸浓度，原因是上面提到的普雷沃氏菌属细菌的数量增加使得蛋白酶活性提高，原虫数量减少使得脱氨酶活性降低，从而使肽和氨基酸等得以积累。

4 结论

①从对瘤胃发酵调控和增加非NH3-N流量2方面考虑，海南霉素浓度为10.0 mg/L为最适剂量。

②海南霉素对瘤胃发酵的调控模式与莫能菌素相似。

③海南霉素是通过对普雷沃氏菌属细菌和原虫的数量的影响来调控氮代谢。

［1］DINIUS D A，SIMPSON M E，MARSH P B.Effect of monensin fed with forage on digestion and the ruminal ecosystem of steers［J］.Journal of Animal Science，1976，42(1):229－234.

［2］HANSON T L，KLOPFENSTEIN T.Monensin，protein source and protein levels for growing steers［J］.Journal of Animal Science，1979，48(3):474－479.

［3］POOS M I，HANSON T L，KLOPFENSTEIN T J.Monensin effects on diet digestibility，ruminal protein bypass and microbial protein synthesis［J］.Journal of Animal Science，1979，48(6):1516－1524.

［4］VAN NEVEL C J，DEMEYER D I.Effect of monensin on rumen metabolism in vitro［J］.Applied and Environmental Microbiology，1977，34(3):251 －257.

［5］黄兵.离子载体抗球虫新药——海南霉素［J］.养禽与禽病防治，2002(5):16－18.

［6］任明强，沈赞明，赵茹茜，等.不同浓度海南霉素对山羊瘤胃消化代谢的影响［J］.南京农业大学学报，1998，21(3):76 －79.

［7］李炯明，庄苏，王恬，等.海南霉素对人工瘤胃体外发酵调控的影响［J］.家畜生态学报，2007，28(1):41－46.

［8］沈赞明，陈杰，任明强.海南霉素对山羊瘤胃内肽的保护作用［J］.南京农业大学学报，2004，27(4):73－76.

［9］TILLEY J M A，TERRY R A.A two stage technique for the in vitro digestion of forage crops［J］.Grass and Forage Science，1963，18(2):104－111.

［10］MCDOUGALL E I.Studies on ruminant saliva.1.The composition and output of sheep’s saliva［J］.The Biochemical Journal，1948，43(1):99 －109.

［11］JOUANY J P.Volatile fatty acids and alcohol determination in digestive contents，silage juice，bacterial cultures and anaerobic fermentor contents［J］.Sciences des Aliments，1982，12(2):131－144.

［12］BRODERICK G A，KANG J H.Automated simultaneous determination of ammonia and total amino acids in ruminal fluid and in vitro media［J］.Journal of Dairy Science，1980，63(1):64－75.

［13］MOORE S.Amino acid analysis:aqueous dimethyl sulfoxide as solvent for the ninhydrin reaction［J］.Journal of Animal Science，1968，243(23):6281－6283.

［14］SIDDONS R C，PARADINE J.Effect of diet on protein degrading activity in the sheep rumen［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1981，32(10):973－981.

［15］STEVENSON D，WEIMER P.Dominance of Prevotella and low abundance of classical ruminal bacterial species in the bovine rumen revealed by relative quantification real-time PCR［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2007，75(1):165－174.

［16］BUSQUET M，CALSAMIGLIA S，FERRET A，et al.Effects of cinnamaldehyde and garlic oil on rumen microbial fermentation in a dual flow continuous culture［J］.Journal of Dairy Science，2005，88(7):2508－2516.

［17］RUSSELL J B，STROBEL H J.Effects of additives on in vitro ruminal fermentation:a comparison of monensin and bacitracin，another gram-positive antibiotic［J］.Journal of Animal Science，1988，66(2):552－558.

［18］YANG C M，RUSSELL J B.The effect of monensin supplementation on ruminal ammonia accumulation in vivo and the numbers of amino acid-fermenting bacteria［J］.Journal of Animal Science，1993，71(12):3470－3476.

［19］WEIMER P J，STEVENSON D M，MERTENS D R，et al.Effect of monensin feeding and withdrawal on populations of individual bacterial species in the rumen of lactating dairy cows fed high-starch rations［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2008，80(1):135－145.

［20］沈向真，朱祖康，陆天水，等.海南霉素和半胱胺对水牛瘤胃消化代谢与增重的影响［J］.江苏农业科学，2003(5):78－82.

［21］IVES S E，TITGEMEYER E C，NAGARAJA T G，et al.Effects of virginiamycin and monensin plus tylosin on ruminal protein metabolism in steers fed corn-based finishing diets with or without wet corn gluten feed［J］.Journal of Animal Science，2002，80(11):3005－3015.

［22］NEWBOLD C J，WALLACE R J，MCKAIN N.Effects of the ionophore tetronasin on nitrogen metabolism by ruminal microorganisms in vitro［J］.Journal of Animal Science，1990，68(4):1103－1109.

［23］HINO T，RUSSELL J B.Effect of reducing-equivalent disposal and NADH/NAD on deamination of amino acids by intact rumen microorganisms and their cell extracts［J］.Applied and Environmental Microbiology，1985，50(6):1368－1374.

［24］WALLACE R J，BRODERICK G A，BRAMMALL M L.Microbial protein and peptide metabolism in rumen fluid from faunated and ciliate-free sheep［J］.British Journal of Nutrition，1987，58(1):87－93.

［25］JOUANY J P.Effect of rumen protozoa on nitrogen utilization by ruminants［J］.The Journal of Nutrition，1996，126(Suppl.4):1335S －1346S.

［26］ZINN R A，PLASCENCIA A，BARAJAS R.Interaction of forage level and monensin in diets for feedlot cattle on growth performance and digestive function［J］.Journal of Animal Science，1994，72(9):2209－2215.