大鼠核转录因子Atoh1的克隆表达及鉴定

郑国玺 祝康 侯瑾 朱珠 韦俊荣 许珉

·实验研究·

大鼠核转录因子Atoh1的克隆表达及鉴定

郑国玺1祝康1侯瑾1朱珠1韦俊荣1许珉1

目的 利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1基因CDS区序列，构建大鼠核转录因子Atoh1的真核表达载体并在真核细胞中表达。方法 从两只SD大鼠结肠黏膜提取总RNA，采用逆转录PCR法扩增Atoh1基因CDS区序列并亚克隆于PMD－19T载体中。测序鉴定后将Atoh1基因连接于含有EGFP和内部核糖体转入位点（IRES）的真核细胞表达载体pIRES2－EGFP中，对重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定后，以脂质体介导法转染至293T细胞，荧光显微镜和Western blot检测其在293T细胞中的表达。结果 扩增得到大鼠Atoh1 CDS区长1 056 bp，编码351个氨基酸，与GeneBank公布的参考序列对比，有两处碱基发生突变，但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致，两处碱基应为单核苷酸多态性（SNP），突变为无义突变，不影响蛋白表达。双酶切和测序结果证明Atoh1已正确地克隆到真核表达载体pIRES2－EGFP中，荧光显微镜和Western blot证实Atoh1目的蛋白能在293T细胞中稳定表达。结论 基因工程方法可成功克隆出Atoh1编码序列，真核表达载体p Atoh1－IRES2－EGFP构建成功并可以在293T细胞中表达。

感音神经性聋； Atoh1； 基因； 克隆； 真核表达载体

大多数感音神经性聋是由毛细胞和与之相联系的螺旋神经损伤和退化所造成，目前尚无确切有效的治疗方法。长期以来人们在探讨毛细胞分化和再生的机制方面做出了不懈的努力，刺激毛细胞的再生从而修复受损听觉和平衡觉已成为当今研究的重点。研究已证实碱性螺旋－环－螺旋（basic helixloop－helix，b HLH）转录因子家族是一类重要的神经发育调节因子，在神经系统发育的多个部位、不同时期发挥神经决定作用。Atoh1基因是b HLH转录因子家族中的一员，是本体感受系统（包括内耳毛细胞，小脑颗粒神经元和桥脑核）发育所必需的因子，调控着复杂的本体感受通路［1］，其在耳蜗发育中的功能是启动调节整个感觉上皮形成的诱导和移植信号系统［2］。Atoh1作为正性调控基因，也是哺乳类动物内耳毛细胞形态和功能再生过程中必不可少的基因，故其在内耳感觉细胞分化过程中的重要调节作用越来越受到研究者的重视。本实验拟通过克隆Atoh1 cDNA编码序列和构建真核表达载体p A-toh1－IRES2－EGFP，进一步探索Atoh1的表达、生物学活性及作用机制，为感音神经性聋的基因治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及主要试剂 大肠杆菌TOP10购于华美生物工程公司；p MD－19T Vector和pIRES2－EGFP真核表达载体购自Invitrogen公司；限制性内切酶SalⅠ、Bam HⅠ、XbaⅠ、T4连接酶及DNA聚合酶购于Ta KaRa公司；质粒小抽试剂盒、PCR反应试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、Trizol total RNA试剂盒等分别购于Axrgen公司和TOYOBO公司；兔抗鼠Atoh1多抗购自美国A-beam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自武汉博士德公司。主要试剂为国产或进口分析纯。

1.2 细胞培养与实验动物 293T细胞（购自中国科学院典藏细胞委员会细胞库）用含10%的小牛血清的RPMI－1640培养液于37℃、5%CO2培养箱培养。实验动物为健康SD大鼠乳鼠两只，鼠龄两天，体重10～20 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 SD大鼠总RNA的提取 参照Trizol totalRNA试剂盒说明书，采用一步法提取SD大鼠结肠组织中的总RNA。从SD大鼠乳鼠切取100 mg新鲜结肠组织，PBS洗涤后加入1 ml Trizol RNA提取液，冰浴中研磨混匀，直至匀浆液呈无颗粒透明状。将裂解液转移至离心管中，在室温下放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。4℃12 000 rpm离心15 min。取上清液加入200μl氯仿，混匀后室温静置15 min，4℃12 000 rpm离心15 min。吸取上清移至新的1.5 ml ep管，加入等体积－20℃预冷的异丙醇，混匀后－20℃沉淀10 min。4℃12 000 rpm离心10 min后，去上清，加入1 ml 4℃预冷的75%乙醇洗涤沉淀，涡旋混匀，4℃10 000 rpm离心5 min，弃上清。吸水纸吸去残液，室温干燥。将沉淀溶于20μl RNase－free水，4℃保存备用。

1.3.2 Atoh1基因CDS区序列的扩增 根据Gen Bank提供的已知序列（GeneID：NM＿001109238.1）应用DNAsis软件设计Atoh1基因CDS区序列引物。上游引物：5＇－ATGTCCCGCCTGCTGC－3＇，下游引物：5＇－CTAACTGGCCTCGTCAGAGTC－3＇。用Mo－MLV逆转录酶将提取的SD大鼠结肠总RNA反转录成cDNA。在PCR扩增仪上以Atohl基因cDNA为模板，进行Atoh1基因CDS扩增。PCR扩增体系：10× Buffer 5μl，MgSO4（50 m M）2μl，d NTP（10 m M）1μl，Taq HiFi（5 U／μl，Invitrogen）0.2μl，Primer F（10 u M）1μl，Primer R（10 u M）1μl，cDNA 1μl，加dd H2O至50μl。反应循环条件为：94℃预变性3 min，94℃30 s、58℃30 s、68℃1 min，35个循环，最后68℃延伸10 min。PCR产物进行10 g／L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3.3 目的片段的亚克隆及鉴定 T4 DNA连接酶连接回收的PCR产物至p MD19－T vector。连接体系为10×T4连接酶Buffer 1μl，PCR产物2 μl，p MD19－T vector载体1μl，T4连接酶1μl，补dd H20至10μl，16℃连接过夜。将5μl连接产物转化至自制TOP10感受态细胞，37℃250 rpm／min振荡培养45 min，使细菌复苏。取200μl转化后的TOP10菌液，涂布于含100μl氨苄霉素（100 mg／m1）和X－gal抗性的LB平皿中，37℃倒置培养过夜，至克隆长出。蓝白筛选挑取白色单菌落进行菌落PCR，PCR鉴定呈阳性者克隆在LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜，质粒DNA小量提取法抽提质粒。分别用限制性内切酶XbaⅠ及Sal I对重组质粒进行双酶切。10 g／L琼脂糖凝胶电泳进行分析鉴定。将菌落PCR和酶切鉴定均呈阳性的克隆送测序，并进行序列比对。

1.3.4 Atoh1基因p IRES2－EGFP表达载体构建及鉴定 重组质粒构建策略与步骤见图1。取5μl连接液转化TOP10感受态细胞，37℃250 rpm／min振荡培养45 min，使细菌复苏。离心收集菌液，涂布于含卡那霉素（100 mg／ml）的LB培养基中，37℃培养过夜，至克隆长出。挑取白色单菌落进行菌落PCR，将PCR鉴定呈阳性的克隆在含卡那霉素抗性的LB液体培养基中培养，摇菌过夜，次日抽提质粒进行酶切鉴定，将菌落PCR和酶切鉴定均呈阳性的克隆送测序，并进行序列比对。

图1 重组真核表达载体p Atoh1－IRES2－EGFP构建示意图

1.3.5 重组质粒pIRES2－EGFP－Atoh1转染293T细胞 用含有100 ml／L胎牛血清的DMEM培养293T细胞，转染前24 h传代，接种入24孔板中，每孔2×105个细胞。依照LipofectamineTM2000转染试剂盒操作说明进行转染，取重组质粒p Atoh1－IRES2－EGFP和空质粒0.8μg各用50μl无血清培养基稀释并混匀，室温下静置孵育5 min。同时，用50μl无血清培养基分别稀释2μl LipofectamineTM2 000并混匀，室温下静置孵育5 min。将两种试剂分别充分混匀，形成不同的转染复合物，室温静置20 min。用400μl完全培养基更换原先的培养基后，将DNA／LipofectamineTM2 000混合物加入24孔板，轻轻混匀，置于二氧化碳（体积分数5%，37℃）培养箱中继续培养24 h，荧光显微镜下观察转染效率。

1.3.6 细胞毒性测定 将293T细胞以1×105／孔接种于96孔板，按上述方法及浓度细胞转染，每孔加入100μl转染试剂，设5个复孔，同时设置5个调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）和5个对照孔（293T细胞、转染试剂、培养基、MTT、二甲基亚砜），5%CO237℃孵育24 h，每孔加入20μl MTT溶液（5 mg／ml，即0.5%MTT），继续培养4 h，吸去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，至摇床上低速振荡10 min，使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490 nm处测量各孔的吸光值，细胞存活率（%）＝实验组光吸收值／对照组光吸收值× 100%。

1.3.7 免疫印迹 转染48 h后，收集细胞.用预冷的PBS洗涤2次，加入400μl细胞裂解液混匀，4℃振荡裂解30 min。细胞裂解物在4℃下12 000 rpm离心20 min。收获上清为样本，经考马斯亮兰法测定蛋白浓度。将各样本等量的蛋白与2×上样缓冲液混匀，待煮沸10 min后置于冰浴中作为电泳样品。同时配制15%聚丙烯酰胺分离胶以等电压100 V电泳，待溴酚蓝达底部边缘后停止，再按100 V电压于90 min内转膜，并将聚偏氟乙烯膜在含0.05%吐温－20的Tris－HCl缓冲液（TBST）中短暂漂洗后置于5%脱脂奶粉TBST封闭液中，于室温内孵育2 h后将膜置入兔抗鼠Atoh1多抗／兔抗鼠β－actin（稀释浓度为1：1000，兔抗鼠β－actin抗体，稀释浓度为1：800）中，于4℃内冰箱过夜；待TBST洗膜10 min×3次后将膜放入第二抗体（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，稀释度为l：2 000）中，予室温反应lh，经TBST洗膜10 min×4次。最后以增强化学发光法显色，于暗盒中X线曝光2 s至2 min；采用图像分析软件ImageJ测条带灰度值，并转换成光密度值作为Atoh1蛋白的相对表达量。

1.4 统计学方法 用SPSS V13统计软件对数据进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析（one－way ANOVA）。

2 结果

2.1 Atoh1基因全长的扩增 电泳图（图2）中可见PCR扩增的1 056 bp大小的目的片段（泳道2），并且与阳性对照Atoh1 cDNA模板（泳道1）条带一致。初步判定PCR扩增出Atoh1全长基因。

图2 Atoh1基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定1：Atoh1 cDNA；2：PCR产物；3：Marker DL5000

2.2 重组质粒p MD－19T／Atoh1的构建及鉴定转化后的TOP10感受态细菌，经过夜培养，获得白色菌落数30～40个／皿，初步表明重组质粒p MD－19T／Atoh1构建成功。酶切鉴定结果（图3）：凝胶电泳结果显示1 056 bp大小的目的条带和2 692 bp大小的p MD－19T载体片段。说明Atoh1已经重组于p MD－19T vertor内。

图3 重组质粒p MD－19T／Atoh1酶切鉴定1：Marker DL5000；2：XbaⅠand SalⅠ双酶切p MD－19 T／Atoh1；3：XbaⅠand SalⅠ双酶切p MD－19T

2.3 目的片段TA克隆测序结果 测序结果显示插入基因片段为1 056 bp，编码351个氨基酸。用NCBI／BLAST软件测序结果与GeneBank公布参考序列序列对比分析，在第606位和720位碱基上有两处突变：606碱基处G突变为A，720碱基处T突变为C。用DNAstar软件对克隆序列所编码的氨基酸序列进行分析，克隆序列长1 056 bp，编码351个氨基酸，与参考序列编码的氨基酸序列一致，两者同源性99%，相似性100%，无读码框移。说明两处突变为无义突变，606 bp与720 bp可能为单核苷酸多态性（SNP）位点，所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，也不影响蛋白的表达。

2.4 Atoh1基因pIRES2－EGFP表达载体构建及鉴定 电泳结果（图4）1 056 bp大小的目的片段和5.3 kb大小的pIRES2－EGFP质粒片段经XbaⅠ酶切，可将质粒线性化，因为XbaI是T载体上SalⅠ和Bam HⅠ之间的酶切位点，在回收目的片段时保留在目的基因末端，而质粒p IRES2－EGFP中没有XbaⅠ酶切位点，电泳结果说明Atoh1已经重组于p IRES2－EGFP质粒中。

图4 p Atoh1－IRES2－EGFP重组质粒酶切鉴定1：Atoh1 cDNA；2：Marker DL2000；3：重组质粒p Atoh1－IRES2－EGFP；4：SalⅠand Bam HⅠ双酶切重组质粒p Atoh1－IRES2－EGFP；5：Marker DL5000；6：XbaⅠ单酶切重组质粒p A-toh1－IRES2－EGFP

2.5 重组真核质粒测序结果 测序结果显示重组真核质粒构建成功，其目的基因插入方向和序列完全正确，编码氨基酸序列与NCBI公布的参考序列一致，无读码框移。

2.6 荧光镜检p Atoh1－IRES2－EGFP质粒在293T细胞中的表达 在转染重组质粒p Atoh1－IRES2－EGFP的293T细胞内可见绿色荧光表达（图5）。计算荧光显微镜下绿色成像细胞数量与普通显微镜下的细胞数量，可得知转染效率约为70%.提示重组质粒p Atoh1－IRES2－EGFP在真核细胞内能显著表达。

图5 重组真核质粒p Atoh1－IRES2－EGFP转染293 T细胞48h后绿色荧光表达a为光学显微镜下48小时后观察未转染组293 T细胞形态（×200）；b为转染空质粒pIRES2－EGFP；c转染重组质粒p Atoh1－IRES2－EGFP；b、c为转染48小时后在荧光显微镜下观察（×200）

2.7 p Atoh1－IRES2－EGFP质粒对293T细胞的毒性作用 未转染空白对照组细胞生存率为100%，转染空质粒和p Atoh1－IRES2－EGFP的细胞生存率分别为82.6%和78.5%。转染空质粒与质粒p Atoh1－IRES2－EGFP后分别与未转染组对比，细胞存活率差异无显著统计学意义（P＞0.05），说明带Atoh1基因质粒的转染对293T细胞的存活无影响。

2.8 免疫印迹 Westem blot结果检测到转染重组质粒组Atoh1蛋白的表达（图6），说明构建的真核质粒可以在真核细胞内正确表达Atoh1基因，同时再次证实两处突变并不影响蛋白的表达。以目的条带与内参条带光密度值计算结果，转染重组质粒pAtoh1－IRES2－EGFP细胞组、转染空质粒组和对照组测定值分别为108.0±2.1、46.3±2.6、38.2±3.0。经方差分析显示，转染重组质粒组的Atoh1表达水平较对照组和转染空质粒组显著增高，差异均有统计学意义（P＜0.01），而转染空载质粒组与对照组的Atoh1表达水平的差异则无统计学意义（P＞0.05）。

图6 转染p Atoh1－IRES2－EGFP质粒后293T细胞中Atoh1蛋白的westem blot鉴定1：对照组；2：转染重组质粒pAtoh1－IRES2－EGFP；3：转染空质粒pIRES2－EGFP.

3 讨论

感音神经性聋因其致病因素和临床表现形式呈现的多样性，使该类疾病目前尚无确切有效的治疗方法［3］。内耳Corti器是负责哺乳动物听觉的感觉器官，耳蜗上皮中分化出的感觉毛细胞和支持细胞之间进行的复杂的排列组合对于内耳功能极为关键［4］。在螺旋器发育的类似成神经阶段，Atoh1可控制支持细胞分化并最终形成一排内毛细胞和三排外毛细胞模式。Pou4f3、Gfil、Barhl1是三种已被证实与毛细胞生存和维护相关的基因，它们在维持毛细胞结构形态的过程中发挥重要作用，然而这些基因的作用发挥都是在Atoh1基因协同下完成的。Atoh1作为正性调控基因，可通过调控POU4F3或其他基因来掌控毛细胞分化。Atoh1突变小鼠内耳上皮Gfi1蛋白表达量呈急剧下降趋势，Atoh1基因缺陷可导致Barhl1表达丧失［5～8］。可见Atoh1在对毛细胞形态和功能再生过程中必不可少的基因。

一定数量的健康毛细胞及螺旋神经节细胞对于神经性耳聋疾病的治疗后听力的提高十分重要［9］。若能将干细胞在一定条件下成功诱导分化成新生毛细胞并移植于内耳，则可解决耳蜗毛细胞损伤后再生的种细胞来源不足的难题。为了更进一步研究Atoh1基因在干细胞中的作用机制及生物活性，本实验扩增出的Atoh1基因测序结果显示克隆的编码序列与参考序列所编码的氨基酸序列一致，两者同源性99%，相似性100%，两处突变为无义突变，突变碱基与未突变碱基的含义相同。证明本研究成功克隆了大鼠Atoh1基因编码序列。

本实验采用的T载体p MD－19T Vector是进行EcoR V酶切后，再在两侧的3′端添加“T”的线性载体。Taq DNA聚合酶进行PCR反应后可在PCR产物的3′末端添加一个“A”，这能更好的保证PCR产物与T载体的高效连接。本实验采用作为标记重组表达质粒的报告基因EGFP是一类提取于发光水母体内的生物发光蛋白，无种属特异性，且无须抗体、辅因子或酶底物等其他介质，当受到紫外或蓝光激发时发射绿色荧光。EGFP作为“生物荧光标签”能方便地监测其在活细胞和生物体中的动态定位和代谢情况，其荧光强度比普通绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）高4～35倍，作为报告基因，其敏感性也明显高于GFP［10］。实现两个基因在一个细胞中共表达的方法通常是采用一个表达载体上两个内启动子，或者是采用融合基因的形式。但上述方法会出现两种基因表达上较大的差异，有时只表达一个基因或者不能保证目的蛋白的正确折叠。本实验选用的真核表达载体pIRES2－EGFP中含有脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点（internal ribosome entrysite.IRES），IRES连接两个开放读码框，其转录产物在翻译时，核糖体能同时进入并开始翻译IRES上游及下游的两个转录子［11］。在CMV启动子下游MCS中的Sal I和Bam H I之间插入Atoh1基因，构建p Atoh1－IRES2－EGFP质粒，在Atoh1和EGFP基因之间巧妙地利用了IRES，IRES允许克隆入多克隆位点的目的基因和EGFP基因从同一个双顺反子mRNA进行翻译，也支持两个目的基因同时并且同水平表达，翻译出来的目的蛋白就各具独立的空间结构和生理活性，而不是融合蛋白，以利于蛋白的正确折叠［12］。由于两者共用一个启动子，因此所有表达选择标记的转染细胞必然也同时表达目的基因，这样就解决了在同一个载体上插入两个基因后可能发生的两个基因互相干扰而不能表达的问题。

利用Atoh1基因转染毛细胞前体细胞或多能干细胞转分化为类毛细胞的研究，虽然已经取得了一定的进展，但是诱导毛细胞再生和移植成活毛细胞的临床应用仍相当遥远。本实验结果证明成功克隆了Atoh1基因的编码序列，并正确构建了真核表达质粒p Atoh1－IRES2－EGFP。经过脂质体介导转染293T细胞48h后，在激光共聚焦荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，为进一步研究Atoh1的表达及生物活性奠定了基础，也为感音神经性聋基因治疗提供了实验依据。

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2 Kanzaki S，Beyer LA，Swiderski DL，et al.p27（Kip1）deficiency causes organ of Corti pathology and hearing loss［J］.Hear Res，2006，214：28.

3 Kawamoto K，Ishimoto S，Minoda R，et al.Math1 gene transfer generates new cochlear hair cells in mature guinea pigs in vivo［J］.Neurosci，2003，23：4 395.

4 Zheng GX，Zhu K，Wei JJ，et al.Adeno－associated viral vector－mediated expression of NT4－ADNF－9 fusion gene protects against aminoglycoside－induced auditory hair cell loss in vitro［J］.Acta Otolaryngol，2011，131：136.

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9 李利，赵立东，邢光前，等.胚胎干细胞向内耳毛细胞诱导分化的研究进展［J］.听力学及言语疾病杂志，2010，18：293.

10 刘英鹏，王国鹏，沈安民，等.重组腺病毒构建及介导报告基因在豚鼠耳蜗中的表达［J］.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007，21：748.

11 Malygin AA，Bochkaeva ZV，Bondarenko EI，et al.Binding of the IRES of hepatitis C virus RNA to the 40S ribosomal subunit：role of protein p40［J］.Mol Biol（Mosk），2009，43：1 070.

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（2011－03－07收稿）

（本文编辑 雷培香）

Construction of A Recombinant Eukaryotic Vector of Atoh1 and Its Expression in 293－T Cells

Zheng Guoxi，Zhu Kang，Hou Jin，Zhu Zhu，Wei Junrong，Xu Min
（Department of Otolaryngology－Head and Neck Surgery，the Second Affiliated Hospital，Medical School of Xi’an Jiaotong University，Xi’an，71004，China）

Objective Useing gene engineering technique to clone SD rats Atoh1 cDNA coding sequence and construct the Eukaryotic expression vector for its expression in eukaryotic cells.Methods Total RNA was extracted from colon of SD rats，by means of asymmetrical primer／template，double stranded cDNA of Atoh1 was gained，then the c DNA coding sequence was cloned into PMD－19T vector and sequenced.The purified digested fragment was connected into Eukaryotic expression vector pIRES2－EGFP with the EGFP gene and the internal ribosomes site（IRES）.Recombinant plasmid was identified by enzyme digestion and sequence analysis，and thea was transfected into 293T cells with Lipofectamine and the expression of protein was detected by fluorescence microscope and Western blotting.Results DNA sequence analysis showed that rat Atoh1 gene amplified length of CDS area 1056bp，encoding 351 amino acids，and contrast the reference sequences published in GeneBank，there were two base mutation in the sequence，it may be Single nucleotide polymorphisms in the nucleotide to induce nonsense mutation，deduced amino acid of cloning sequences as the same as reference sequences.Two bases were single nucleotide polymorphism（SNP），and mutation was a nonsense mutation，did not affect protein expression.Enzyme digestion and sequence analysis of recombinant plasmid demonstrated that Atoh1 gene was correctly inserted into eucaryotic expression vector plRES2－EGFP.The expression of the green fluorescent protein in the293T cells was observed by fluorescence microscopeafter recombinant plasmid into 293T cells 48 h.The mRNA and protein expression of Atohl in infected 293T had been comformed by Western blotting.Conclusion Atoh1 CDS region was cloned and recombinant plasmid has been constructed successfully，and the Atoh1 of pIRES2－EGFP－Atoh1 was successfully expressed in the 293T cells，which will guide further research on genetherapy for sensorineural hearing loss.

Sensorineural hearing loss； Atoh1； Gene； Clone； Eukaryotic expression vector

10.3969／j.issn.1006－7299.2011.05.015

时间：2011－9－5 12：50

R764.3

A

1006－7299（2011）05－0438－06

* 国家自然科学基金（NO.30471877）、陕西省科技攻关项目（NO.2010K15－08）资助

1 西安交通大学医学院第二附属医院耳鼻咽喉头颈外病院（西安 710004）

郑国玺，男，西安人，医学博士，教授，主要从事耳病和神经生物学研究。

郑国玺（Email：zhengguoxi＠21cn.com）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20110905.1250.008.html