痛风方剂颗粒质量标准研究＊

姚苑梅 ，徐玉红，李 东，万于军

(1.广东医学院附属福田人民医院，广东 深圳 518033;2.广东省深圳市人民医院·暨南大学第二临床医学院临床药学研究室，广东 深圳 518020)

痛风方剂是临床使用多年且经临床观察证实疗效可靠的经验方，治疗痛风的总有效率在90%以上[1]。为便于携带和临床应用，提高患者依从性，运用现代制药技术对其进行了剂型改造，将其制成颗粒剂，并进行了动物药效学研究[2]。为保证制剂质量的稳定、可控，确保临床疗效，根据医院制剂报批要求，对其质量控制方法进行了研究，报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪，包括G1311A四元泵，G1322A真空脱气机，G1315B-DAD检测器，D1316A柱温箱，rheodyne-7725i手动进样器，ChemStation色谱工作站;UV-2201型紫外分光光度计(日本岛津);ZF-Ⅰ型三用紫外分析仪(365 nm，上海顾村电光仪器厂);CQX25-06型超声波清洗器(上海必能信超声波有限公司);AG285型电子天平(梅特勒托利多仪器有限公司)。痛风方剂颗粒(医院制剂室制备，10 g/包，每克含量相当于原药材2.25 g，批号分别为20100817，20100912，20101106);粉防己碱对照品(批号为 110711-200507)、防己诺林碱对照品(批号为 110793-200605)、盐酸小檗碱对照品(批号为110713-200609)均由中国药品生物制品检定所提供;防己、黄柏、当归对照药材由深圳市药品检验所提供。薄层层析硅胶G(青岛海洋化工厂);甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余辅料均符合药用标准，试剂均为分析纯。所有试液使用前均经0.45 μm微孔滤膜过滤。

2 方法与结果

2.1 性状

按痛风颗粒剂制备工艺和处方量制备3批样品，观察描述制剂的外观性状。本品为棕黄色颗粒，气微，味苦涩。

2.2 检查

3批样品按2005年版《中国药典(一部)》附录ⅠC颗粒剂项下有关的各项规定进行检查，结果符合规定[3]。

2.3 薄层色谱鉴别

2.3.1 防己[3-4]

取痛风颗粒3 g，加70%乙醇30 mL溶解，加入浓氨水2 mL，超声提取20 min，再加氯仿20 mL萃取，取氯仿层，40℃水浴挥干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。取不含防己的阴性样品3 g，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取防己对照药材2 g，加70%乙醇30 mL，同法制成对照药材溶液。另取粉防己碱、防己诺林碱对照品，用甲醇溶解制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验[3]，吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠(含1%氢氧化钠)为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-氯仿-甲醇(7.5∶4∶2)为展开剂，在室温下展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱和对照品溶液色谱相应位置上分别显相同颜色的橙黄色斑点，阴性对照品溶液无干扰(图1 A)。

图1 薄层色谱图

2.3.2 黄柏[3]

取痛风颗粒5 g，加1%醋酸甲醇溶液30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液40℃水浴挥干，用甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。取不含黄柏的阴性样品5 g，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取黄柏对照药材0.5 g，加1%醋酸甲醇溶液，同法制成对照药材溶液。另取盐酸小檗碱对照品，以甲醇制溶解制成每1 mL含0.5 mg的对照品溶液。照薄层色谱法试验[3]，吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，置氨蒸气预饱和的层析缸内，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂，在室温下展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的黄色荧光，阴性对照品溶液无干扰(图1 B)。

2.3.3 当归[3，5]

取痛风颗粒5 g，加乙醚40 mL，超声处理20 min，滤过，滤液40℃水浴挥干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取不含当归的阴性样品5 g，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。另取当归对照药材1 g，加乙醚40 mL，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验[3]，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，在室温下展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上分别显相同颜色的蓝色荧光，阴性对照品溶液无干扰(图1 C)。

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件与系统适用性试验[6-8]

色谱柱:Kromasil C8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:含 0.6% 三乙胺的0.01 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调pH至3.0)-甲醇-乙腈(50∶20∶30);流速:1.0 mL/min;柱温:室温;检测波长:280 nm;进样量:20 μL。在此色谱条件下，防己碱和样品中其他组分色谱峰达到基线分离，理论板数按计应不低于4 000，色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图

2.4.2 溶液制备

精密称取干燥至恒重的粉防己碱对照品10.0 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得质量浓度为100.0 μg/mL的对照品贮备溶液。取本品内容物适量，研细，取约2.0 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加入氨试液2 mL，加甲醇近刻度，超声(功率160 W，频率40 kHz)处理20 min，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，置中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径1.5 cm)上，用甲醇 40 mL洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。制备缺防己的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液。

2.4.3 方法学考察

专属性考察:分别精密吸取2.4.2项下3种溶液各20 μL，按上述色谱条件进样。结果表明，供试品溶液中粉防己碱的保留时间与对照品溶液一致，约为6.2 min，按样品处理方法处理后，粉防己碱与其他成分达到基线分离，阴性对照品溶液没有干扰(图2)。

线性关系考察:分别精密量取质量浓度为100.0 μg/mL的对照品溶液 1，2，4，6，8，10 mL，置 25 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述条件分别进样20 μL。以质量浓度(C)为横坐标、相应的峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，得回归方程 A=15.26C+0.68(r=0.999 8)。结果表明，粉防己碱质量浓度在4.0～40.0 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:取质量浓度为24.0 μg/mL的对照品溶液，重复进样6次，测定峰面积。结果的 RSD为0.89%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，每隔1 h进样1次，连续测定12 h。结果的 RSD=1.27%，表明供试品溶液至少在12 h内稳定。

重复性试验:取同一批(批号为20101106)样品，按样品含量测定方法操作。结果平均含量为0.223 7 mg/g，RSD=1.86%(n=6)。

加样回收试验:称取已知含量的样品(批号为20101106)1.0 g共9份，分别按低、中、高3个量级加入粉防己碱对照品，按含量测定方法进行测定，记录峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 粉防己碱加样回收试验结果(n=9)

2.4.4 样品含量测定

取3批样品，每批平行取样3份，按溶液制备项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样20 μL进行测定，计算含量。结果3 批样品含量分别为 235，218，224 μg/g。

3 讨论

进行薄层鉴别时，按中医组方理论选取方中主药且化学成分明确、药理研究较为透彻的防己、黄柏、当归3种药材做鉴别[9-11]。在选择展开条件时，各药材均首先按药典规定的展开条件进行试展开，但由于组方中药材较多，可能存在各化学成分相互影响的现象，药典收载的展开剂系统并不能完成适用于本组方中的药材鉴定，为达到高质量的鉴别效果，对展开剂进行了试验性调整。

在鉴别防己时，先后对三氯甲烷-丙酮-甲醇(6∶1∶1)、氯仿-乙酸乙酯-甲醇(7∶2∶1)、正己烷-氯仿-甲醇(7.5∶4∶2)3个展开剂系统进行预试验，第1个系统无斑点显示，第2个系统展开后斑点较为扩散。采用含1%氢氧化钠的羧甲基纤维素钠铺板，以正己烷-氯仿-甲醇(7.5∶4∶2)为展开剂，取得了较好展开效果，且展开重复性好;供试品溶液在碱性条件下以三氯甲烷提取后，斑点更为清晰。

鉴别黄柏时，使用2005年版《中国药典(一部)》黄柏药材项下的鉴别方法，供试品溶液对应位置无黄色斑点或荧光显示，借鉴2000年版《中国药典(一部)》黄柏药材项下的展开剂系统[12]，分离效果得到改进，但有干扰，试用正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂后，展开斑点较清晰。展开前用氨蒸气饱和后，可明显提高展开速度，荧光斑点更为清晰。

鉴别当归时，最初使用药典当归药材项下的展开剂系统正己烷-乙酸乙酯，但斑点过大，存在拖尾现象，将正己烷改为石油醚，以石油醚-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，效果明显改善。

采用文献报道的粉防己碱含量测定方法[8-10]，粉防己碱保留时间较长，改用C8柱后可缩短分析时间，特别是加入三乙胺后，峰形得到明显改善。试验中考察了不同样品处理方式对含量测定结果的影响，结果发现以适量氨水碱化样品后，可明显提高待测样品的溶出量。为消除其他成分的干扰，试验采用中性氧化铝柱对样品进行分离浓缩。

本研究表明，所建立的薄层色谱鉴别法和高效液相色谱法专属性强、重复性好，可满足痛风方剂颗粒的质量控制要求。

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