高效液相色谱法测定人血浆中地西泮和咪达唑仑含量

余学军，陈琴华，李 鹏，杨 曼

(湖北医药学院附属东风医院药剂部，湖北 十堰 442008)

地西泮(diazepam)和咪达唑仑(midazolam)均属苯二氮类(benzodiazepines)药物，由于毒性小、临床用途多，已逐渐替代巴比妥类药，成为当前临床应用最广的镇静催眠药，在临床麻醉中作为麻醉前用药、辅助用药和复合全身麻醉的组成部分[1-2]。临床上地西泮常用于控制肌痉挛和抽搐，如破伤风、癫痫发作、局部麻醉药中毒等，其个体差异大、治疗范围小，且典型毒性并不一致，滥用或误用常引起中毒，且中毒程度与血药浓度密切相关[3-4]。咪达唑仑具有水溶性和消除半衰期短的特点，主要用于麻醉前、全身麻醉诱导和维持、局部麻醉和部位麻醉辅助以及重症监护患者的镇静等，监测咪达唑仑的血药浓度、合理调整用药剂量，是减少其不良反应、提高疗效的直接手段之一[5-6]。临床上常见这两种药物同时使用。笔者建立了同时测定地西泮和咪达唑仑血药浓度的高效液相色谱法，现报道如下。

1 仪器与试药

CP 225 D型十万分之一分析天平(Sartorius);Waters 2695-2996型高效液相色谱仪;WH-1型微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司);2-16型超速离心机(Sigma)。地西泮对照品(批号为 171225-200302)、咪达唑仑对照品(批号为171250-200401)均由中国药品生物制品检定所提供;乙腈、甲醇为色谱纯，水为纯化水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Waters C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈 -水(55∶45);流速:1.0 mL/min;检测波长:220 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 μL。色谱图见图1，咪达唑仑和地西泮的保留时间分别为 7.2 min和 9.7 min。

图1 高效液相色谱图

2.2 对照品溶液制备

分别精密称取地西泮和咪达唑仑对照品10.0 mg，置10 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度即得质量浓度为1.0 g/L的对照品贮备液，置冰箱备用。临用前混合，并以甲醇稀释;混合对照品溶液中地西泮和咪达唑仑质量浓度均为100 μg/mL。

2.3 样品预处理

取空白血浆0.3 mL，置2 mL具塞试管中，加0.1 mL甲醇，旋涡混匀，再加乙腈0.6 mL，旋涡混旋1 min，10 000 r/min高转速离心10 min，精密吸取上清液，进样20 μL。

2.4 方法学考察

标准曲线绘制:取空白血浆0.3 mL，精密加入一定量混合对照品溶液，置2 mL具塞试管中，配成含地西泮和咪达唑仑分别为0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL 的系列血浆样品溶液，照2.3项下样品预处理方法处理后测定峰面积。以峰面积(A)对血浆质量浓度(C)进行线性回归，得回归方程咪达唑仑 A=132 565 C+1 235.8(r=0.999 8);地西泮 A=118 097C+17 508(r=0.999 0)。地西泮和咪达唑仑质量浓度均在0.05～10.0 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好，最低检测质量浓度均为5 ng/mL(S/N＞3)。

回收率和精密度试验:取人空白血浆0.3 mL，精密加入质量浓度分别为0.1，5.0，10.0 μg/mL的混合对照品溶液，按2.3项下方法处理样品，作为质控样品，每个质量浓度质控样品各制备5份，进样分析，结果用药物峰面积表示，带入回归方程计算回收率。同时考察1 d内制备的3种质量浓度质控样品，每个样品测定5次，计算日内精密度的 RSD;另在同1周内不同天内分别测定，计算日间精密度的 RSD。结果见表1。

表1 咪达唑仑和地西泮在人血浆中的回收率和精密度试验结果

稳定性试验:分别制备3种质量浓度的质控样品各10份，分为2组，一组在25℃下保存2 h，一组在-20℃下保存1个月，按2.1项下色谱条件进样分析，将测得值与第1天的值比较。结果见表2。

表2 咪达唑仑和地西泮在人血浆中的稳定性试验结果

3 讨论

文献介绍的大多是碱化后乙醚提取的样品处理方法，处理步骤复杂、费时。本试验采用乙腈沉淀蛋白，取上清液直接进样的方法，去蛋白效果良好，回收率高，且简便、稳定性好。另外，多数试验以缓冲盐作流动相，不利于仪器的保养与维护。本试验以乙腈-水(55∶45)为流动相，通过优化试验条件，使地西泮和咪达唑仑以及内源性物质达到了良好分离。

[1]李 螈，袁 汀，段 旭，等.高效液相色谱法测定地西泮中毒患者血浆与尿中地西泮浓度[J].医药导报，2007，26(12):1 415-1 417.

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[4]刘冬娴，贺江南.GC-ECD法检测血浆中地西泮及去甲西泮[J].西北药学杂志，2005，20(2):51-52.

[5]田志松.高效液相色谱法同时测定人血浆1’-羟基咪达唑仑与咪达唑仑含量[J].医药导报，2006，25(5):404-405.

[6]毛桂福，郭 涛，夏东亚.用RP-HPLC法测定人血浆中咪达唑仑的含量[J].药学服务与研究，2008，8(4):297-299.