青钱柳愈伤组织诱导1)

2011-05-31张志敏张颖颖谢寅峰杨万霞尚旭岚方升佐

东北林业大学学报 2011年9期

张志敏张颖颖谢寅峰杨万霞尚旭岚方升佐

(南京林业大学，南京，210037)

青钱柳(Cyclocarya paliurus(Bata.l)Ijinskaja)，系胡桃科青钱柳属植物［1］，又名青前李(江西)、山麻柳(四川)、甜茶树(贵州)、一串钱(湖北)等，是我国独有的单种属植物，也是国家重点保护的濒危植物之一。青钱柳种子具有深休眠习性，自然生长的青钱柳不仅数量少，且多零星分布于深山老林，自然更新率低，人工栽培青钱柳的成活率也不高［2］，严重影响了青钱柳的开发利用与产业化进程。植物的各种器官及组织经培养均可产生愈伤组织，并能不断继代繁殖。愈伤组织可以作为研究植物脱分化和再分化、生长和发育、遗传和变异、育种及次生代谢物生产的理想材料，此外，还是悬浮培养的细胞、原生质体的来源［3］。文中以青钱柳3年生幼树上嫩茎和叶片作为外植体，研究不同消毒剂配方、不同培养基种类及不同质量浓度的生长调节剂对青钱柳愈伤组织的影响，筛选出获得大量愈伤组织的最优方案，为进一步建立青钱柳组培快繁及悬浮培养体系提供基础。

1 材料与方法

采自江苏镇江南京林业大学教育基地。取3年生青钱柳幼树当年生的嫩枝作为外植体，采后立即进行冰盒保鲜，在2 h内带回实验室进行材料的预处理。以嫩叶和茎段作为诱导愈伤组织的材料。

外植体预处理与消毒:取青钱柳幼树上当年生枝条上的嫩叶，嫩枝剪成1.5～2 cm长的茎段，分别先用流水冲去表面的脏物，体积分数为1%的洗洁精溶液浸泡3 min，再用软刷轻轻刷洗外植体表面，除去附着在茎、叶表面上的尘土和部分菌体，在流水中冲洗1～2 h。沥水后，浸在蒸馏水中待用。预处理后的材料在超净工作台上进行消毒处理。各处理后均用无菌水冲洗5～8次。然后在超净工作台上将叶片剪成0.5 cm×0.5 cm的方块，茎段剪成0.5～1 cm的长条接种到预先配好的培养基中，进行愈伤组织的诱导。叶片每个处理接10瓶，茎段每个处理接种7～9瓶，各处理均重复3次。消毒处理方法见表1。接种后定期观察，随时取出污染的培养瓶，并记录污染数。30 d后统计污染率、褐化死亡率、诱导率。

培养基与培养条件:以MS为基本培养基，添加2 mg·L－16 －BA+0.5 mg·L－1NAA+30 g·L－1蔗糖 +6.5 g·L－1琼脂，pH值调至5.8。每瓶内盛30 mL固体培养基。培养温度 25 ℃;光照强度 50 μmol·m－2·s－1;光期 14 h，暗期 10 h;相对湿度50%～70%。

表1 对叶片(茎段)不同消毒处理的正交设计

愈伤组织诱导培养基筛选:采用单因素设计，以WPM、改良DKW、MS、改良MS、DY、B5六种基本培养基进行诱导试验。叶片每处理接种10瓶，试验重复3次。茎段每处理接种5瓶，重复3次。接种后定期观察，记录愈伤组织形成开始的时间、接种数、诱导出的愈伤组织数目、污染数目、褐化死亡数目，30 d后统计诱导率、褐化率。培养期间及时取出污染的外植体，以免交叉污染。

植物生长调节剂种类及质量浓度对愈伤组织诱导的影响:采用 KT、2，4 － D、NAA 三因素［4］，三水平 L9(33)正交试验设计(表2)。以MS为基本培养基，添加30 g·L－1蔗糖+6.5 g·L－1琼脂，pH值调至5.8。每处理接种15瓶，每瓶接3个叶片。接种后定期观察，记录愈伤组织形成开始的时间、接种数、诱导出的愈伤组织数目、诱导率、愈伤组织的颜色状态。30 d后统计诱导率。

表2 不同植物生长调节剂种类及其质量浓度对愈伤组织诱导的正交设计

观察统计:培养30 d后统计各个处理的污染率、褐化死亡率、诱导率等指标。指标计算方法如下:

污染率=(污染的外植体数目/接种的外植体数目)×100%;

褐化死亡率=(褐化死亡的外植体数目/未污染的外植体数目)×100%;

诱导率=(诱导出愈伤组织的外植体数目/未污染的外植体数目)×100%。

数据分析:试验数据利用Excel、STST统计分析软件进行方差、极差等分析，并用Duncan氏法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 消毒方法的筛选

利用不同消毒方法对青钱柳叶片及茎段愈伤组织进行诱导，筛选出最合适的培养基组合。参试酒精和升汞配比的叶片愈伤组织污染率依次为 10.00%、6.67%、6.67%、3.33%、3.33%、3.33%、0、0、0;死亡率依次为 3.70%、7.14% 、17.86% 、20.69%、27.59%、31.03%、33.33%、40.00%、50.00%;诱导率依次为 96.30% 、92.86%、82.14%、79.31%、72.41%、68.97%、66.67%、60.00%、50.00%。由表3可看出，叶片消毒灭菌的最佳组合为70%酒精0 s+0.1%升汞4 min，与其他处理相比，差异均达极显著水平(p＜0.01)。极差分析结果表明，酒精的处理时间是影响消毒和诱导效果的主要因素。而升汞的处理时间对消毒和诱导效果的影响不明显。2种消毒液配合使用并准确控制消毒时间，才能使污染率、死亡率控制在最低，以减少对叶片组织细胞的伤害，进而得到较高的诱导率。参试酒精和升汞配比的茎段愈伤组织污染率依次为33.33%、25.00%、21.74%、13.04%、9.09%、4.76%、8.33%、4.55%、0;死亡率依次为 5.56%、11.11%、22.22%、5.00%、10.00%、20.00%、13.64%、19.05%、37.04%;诱导率依次为 94.44%、88.89% 、77.78% 、95.00% 、90.00%、80.00%、86.36%、80.95%、62.96%。茎段消毒灭菌的最佳组合为70%酒精10 s+0.1%升汞4 min，其次为70%酒精10 s+0.1%升汞8 min，差异不显著(p＞0.05)。极差分析结果也和叶片存在差异，酒精是影响消毒灭菌的主要因素，而升汞是影响诱导率的主要因素。因此，以茎段作外植体，酒精应控制在10 s，升汞应控制在4～8 min，此时的污染率较低，愈伤组织的诱导率较高。

表3 不同消毒处理对青钱柳叶片(茎段)愈伤组织诱导正交试验极差分析

2.2 培养基对愈伤组织诱导的影响

表4结果显示，6个基本培养基对叶片愈伤组织诱导影响效果由大到小的顺序为 MS、DY、改良 MS、WPM、DKW、B5，其中MS效果最佳，诱导率最高(96.37%)，褐化率最低(3.63%)。与其他处理差异均达极显著水平(p＜0.01)。其次为DY和改良MS，诱导率分别为89.02%和88.28%。褐化率也较低分别为10.98%和11.72%。B5效果最差，诱导率最低(57.03%)，褐化率最高(42.97%)。从颜色状态来看，MS、改良MS、DY培养基的愈伤组织较好，松散、淡绿色或白色，适于增殖培养。与叶片不同，基本培养基对青钱柳茎段愈伤组织诱导的影响效果由大到小的顺序为:改良 MS、DY、B5、MS、DKW、WPM。其中改良MS的诱导率最高(95.56%)，褐化率最低(4.44%)，其次为 DY 诱导率为91.11%，褐化率为 9.23%，和其他处理相比达极显著差异(p＜0.01)。MS、改良MS、DY培养基的愈伤组织的颜色状态和叶片相似。

表4 基本培养基对青钱柳叶片(茎段)愈伤组织诱导的影响

2.3 植物生长调节剂对愈伤组织诱导和颜色状态的影响

培养基配方是否适当直接影响外植体的分化与生长，各种生长调节剂的配比显得尤为关键［5］。本试验参试激素配比的愈伤组织诱导率依次为66.67%、70.00%、82.93%、72.09%、67.50%、97.50%、68.18%、61.90%、85.00%。由表 6 可看出 KT0.5 mg·L－1+2，4 －D2.0 mg·L－1效果最好，诱导率最高。与其他处理相比，差异达显著水平(p＜0.05)。极差分析结果表明，2，4－D质量浓度对叶片愈伤组织的诱导影响最大，是影响诱导率的主要因素。随着2，4－D质量浓度的增大诱导率逐渐增大，最佳质量浓度为2.0 mg·L－1。其次为KT，而NAA的影响效果最小。最佳激素和质量浓度组合为KT0.5 mg·L－1+2，4 － D 2.0 mg·L－1+NAA0.1 mg·L－1。表6结果也显示，不同生长调节剂配比对愈伤组织生长量和颜色状态也存在不同的影响作用，且和诱导率相符，即诱导率愈高的组合，愈伤组织的生长量也越多。

表5 植物生长调节剂对青钱柳叶片愈伤组织诱导的正交试验极差分析

表6 植物生长调节剂对青钱柳叶片愈伤组织颜色状态的影响

3 结论与讨论

升汞作为组培常用的外植体灭菌消毒剂，消毒效果较好。但处理时间过长易对外植体产生伤害和导致褐变，时间过短则又不能消毒彻底［6］。本研究表明，青钱柳叶片和茎段消毒灭菌的最佳组合分别为70%酒精0 s+0.1%升汞4 min和70%酒精10 s+0.1%升汞4 min。污染率和褐化死亡率最低，愈伤组织诱导率最高。由于叶片诱导愈伤组织量较多，污染率和褐化死亡率相对较低，为获得大量优质的愈伤组织，选用青钱柳叶片作为诱导愈伤的外植体材料较为适宜。

基本培养基的组成直接影响细胞的生长及次生代谢物的产生，其中氮源的影响较为明显［7－10］。上官新晨［4］等的研究结果表明，改良MS培养基不仅有利于愈伤组织的生长。有研究表明［11］，还原态NH+4对植物脱分化形成愈伤组织是有利的，且不能被硝态氮(NO3－)所代替，培养基中适当比例的NH4+/NO3－能促进愈伤组织的生长。本研究表明，青钱柳茎段在改良MS培养基上诱导效果最好，叶片在MS培养基上效果最好，其原因可能是青钱柳愈伤组织诱导需要稍高比例的氨态氮和硝态氮。

生长素和细胞分裂素有效结合时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成［12］。一般高质量浓度的生长素和低质量浓度的细胞分裂素有利于愈伤组织的诱导。本试验KT0.5 mg·L－1+2，4 －D2.0 mg·L－1组合效果最好，诱导率最高(97.50%)。李玉静等［13］认为2，4－D是诱导愈伤组织必不可少的因子，与6－BA配合使用对愈伤组织的培养效果更好，当2，4－D为2.0 mg·L－1、6 － BA 为0.5 mg·L－1时水稻愈伤组织的诱导率最高。本试验结果表明，2，4－D在愈伤组织的诱导过程中起了决定性的作用，最佳质量浓度为2 mg·L－1;但高质量浓度的2，4－D使愈伤组织松散且褐化增多，与杨婷婷等［14］的研究结果类似。可能是高质量浓度的2，4－D会增强愈伤组织内多酚氧化酶活性，从而导致愈伤组织褐化甚至变黑死亡［4］。因此，在青钱柳愈伤组织的诱导中，应尽量减少2，4－D的用量，以得到颜色、状态较好的愈伤组织，为后期的增殖和分化打下良好的基础。

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