榆树皮粗多糖组成及体外抗氧化作用

2011-08-09杨明非

东北林业大学学报 2011年9期

杨明非

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

多糖是一类天然大分子化合物，其作为药物始于1943年。之后数十年的研究逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能，多糖作为广谱免疫促进剂引起了人们极大的兴趣。特别是近十年来人们对糖的认识有了质的飞跃，现确定植物多糖的主要功能有：调节免疫、抑制肿瘤、延缓衰老、降血糖等作用。因此，对多糖类的研究再次成为人们关注的焦点。榆树皮中就含有大量的黏液质(植物多糖)。榆树(Ulmus pumila L.)在我国自然分布较广，且耐旱、耐寒、耐瘠薄。榆树根系发达，抗风保土力强，在较干旱的贫瘠荒丘坡地都可较好生长，可谓资源丰富。榆树皮又称榆白皮，主要功用有：利水、通淋、消肿等，为常见中药。已知榆树皮中的成分有：β-谷甾醇、植物甾醇、豆甾醇、鞣质、树胶及脂肪油等［1］。但是对榆树多糖的组成、作用等研究尚未见报道。本文从榆树皮中提取榆树多糖，以确认榆树皮多糖的组成，进而研究它的抗氧化活性，为榆树皮的进一步研究、开发应用提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试材

仪器：TU—1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器公司);Avatar360型傅立叶变换红外光谱仪(Thermo Nicolet);6890N气相色谱仪(Agilent Technologies)。

试样：鲜榆树皮剪段，低温脱水并干燥粉碎(含水率41.13%)，采用索氏提取法在90℃下用无水乙醇除杂质，备用。

试剂：所用试剂均为分析纯或生化试剂。

1.2 多糖提取

榆树皮多糖以水提取，方法参照文献［2］：精称10 g干样，料液比1 g∶70 g，80℃水浴回流浸提3 h，冷却，过滤，Sevage法除蛋白，浓缩至原体积的1/7，加入4倍体积无水乙醇，醇析沉淀，静置过滤，留滤渣，低温干燥，制得粗多糖。

1.3 粗多糖成分分析

粗多糖紫外可见光谱分析：配制质量浓度为6.4 g·L-1粗多糖水溶液。波长扫描范围：200～800 nm。

红外光谱表征：用KBr压片法测试榆树粗多糖红外光谱图。

粗多糖组成的气谱分析参照文献［3］进行。

①粗多糖水解。H2SO4水解法，得水解单糖备用(衍生化略)。

②标准糖衍生化。称取木糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖、葡萄糖各约10 mg，分别加入20 mg盐酸羟胺、20 mL吡啶，振荡，90℃水浴30 min，取出冷却后加2.0 mL乙酸酐于90℃水浴中酰化30 min，浓缩至5 mL，冷却。

③肌醇六乙酸酯(内标物)的制备。用肌醇配制成质量浓度为1 g·L-1的甲醇溶液，制备同②。

④色谱试样准备。取各标准糖衍生物、粗多糖水解衍生物适量，分别加入内标物(肌醇六乙酸酯)适量，混匀备用。

⑤气谱条件。气谱柱型号PH—5，30 mm×0.25 mm×0.25μm。程序升温：40℃ 5 min，8℃·min-1升温至260℃，保持30 min。汽化室温度250℃，FID为250℃，载气为N2，进样量0.5 μL。

采用标准糖定性内标法定量，分析榆树皮多糖组成。

1.4 粗多糖抗氧化性

1.4.1 普鲁士蓝法比较粗多糖与Vc还原能力

粗多糖还原能力测定方法参照文献［4］进行。

取用不同质量浓度的粗多糖溶液及Vc溶液(Vc为对比物)，加入各试剂启动反应，放置10 min，于700.00 nm处测定其吸光度A。A值越大，样品的还原能力越强。

1.4.2 粗多糖与Vc清除羟自由基(Smirnoff法)比较

粗多糖清除羟自由基试验方法参照文献［5］、［6］进行。

①分析波长。取用质量浓度分别为2.210 g·L-1的粗多糖溶液及0.4050 g·L-1Vc 适量，依次加入5.00 mL 9.0 mmol·L-1FeSO4、5.00 mL 9.5 mmol·L-1水杨酸—乙醇溶液，用蒸馏水补齐体积至 15.00 mL，摇匀，再加入 8.8 mmol·L-1H2O2溶液5.00 mL启动反应，摇匀后于37℃条件下反应30 min，迅速在紫外—可见分光光度计上扫描，波长扫描范围是200.00～800.00 nm。粗多糖溶液及Vc均不引起特征吸收峰位移，确定分析波长为525.00 nm。

②羟自由基生成时间。试验步骤如①，测定反应时间为0～60.0 min时段的吸光度A525.00nm。反应于15 min后趋于稳定，时间确定为15 min。

③榆树粗多糖与Vc清除羟自由基比较。粗多糖样品对羟自由基的清除能力按下式计算：SA=((A0-(Ai-Ai0))/A0)×100%。式中：A0为总自由基的吸光度;Ai为粗多糖消除自由基后的吸光度;Ai0为粗多糖本底吸光度。

①扫描时间段。从加入邻苯三酚溶液1 min后计时，20 s/次，连续扫描共 20 min，测定 A319.00nm。

②粗多糖对超氧自由基清除作用。取质量浓度为1.476 g·L-1粗多糖溶液分别为 0、3、5、8、10、13、15 mL，测定各自氧化速率。

2 结果与分析

2.1 粗多糖光谱分析结果

按1.2中的方法提取粗多糖，其提取率为116.3 mg·g-1。用此粗多糖测定紫外可见光谱，见图1。由图1可见：粗多糖溶液在260 nm处无核酸吸收;在280 nm处无蛋白吸收。说明粗多糖无核酸、无蛋白干扰，较纯。

图1 榆树皮粗多糖水溶液紫外光谱图

用KBr压片法获得榆树粗多糖红外光谱图(图2)。图2中：3 419 cm-1(宽峰)为糖类等O—H伸缩振动;1 417 cm-1为C—O伸缩振动;1 326 cm-1为C—H变角振动，这是由D—葡萄糖、D—甘露醇、D—木糖和半乳糖醛酸组成糖类的特征吸收峰;1 070 cm-1处双峰为呋喃糖苷的特征吸收;603 cm-1为O—H的外平面振动峰。红外谱图表明该物质是多糖［6-7］。

2.2 粗多糖组成的气谱分析

肌醇衍生化制备肌醇六乙酸酯(内标物)经气谱分析为单峰，相对含量大于99.5%，可作内标物。榆树皮粗多糖色谱分析表明，粗多糖由6种单糖组成。定性、定量结果见表1。

2.3 粗多糖与Vc还原能力的比较

榆树粗多糖具有很强的还原能力，且还原能力随质量浓度增加而明显递增。榆树粗多糖质量浓度低于0.221 0 g·L-1时，其还原能力比对照物Vc差;当粗多糖质量浓度大于0.441 9 g·L-1时，其还原能力要强于同等质量浓度的Vc;质量浓度在0.6～1.5 g·L-1时，榆树粗多糖的还原能力比Vc高出50%～70%，还原能力很强。试验结果见表2。

图2 榆树皮粗多糖红外光谱图

表1 粗多糖水解单糖定性、定量结果

表2 榆树粗多糖与Vc还原能力

2.4 粗多糖与Vc清除羟自由基的比较

清除羟自由基的分析波长为525.00 nm。羟自由基生成时间在反应15 min后趋于稳定，测试时间确定为15 min。榆树粗多糖与Vc清除羟自由基的比较结果见表3。

由表3 可见，Vc 质量浓度从0.10 g·L-1增加到0.25 g·L-1时，对羟自由基的清除率陡然上升，之后趋于平缓。榆树粗多糖质量浓度从0.2～0.52 g·L-1是稳步上升的，但是对羟自由基的清除率远不如Vc。

2.5 粗多糖清除超氧自由基(O-2·)

采用邻苯三酚自氧化法测定粗多糖清除超氧自由基(O-2·)，其中间产物的积累在滞后30～45 s时与时间呈良好的线性关系，该有色产物在319 nm处有强烈的紫外吸收，见图3。

清除超氧自由基的反应在0～5 min时可近似表示为一元线性方程(y=0.115 5x+0.164 1;相关系数 R2=0.994 2)，确认扫描时间段为0～5 min。

不同体积下粗多糖对超氧自由基清除作用的各自氧化速率(各自氧化曲线方程的相关系数R2均大于0.99)见表4。

表3 榆树粗多糖与Vc清除羟自由基比较

图3 榆树皮粗多糖清除超氧自由基分析波长

3 结论

榆树皮中含有较多的多糖。以水提取获得的粗多糖质量分数为116.3 mg·g-1。气谱标准物定性表明，粗多糖由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和甘露醇组成，定量分析结果分别为：168.7、182.2、120.1、66.0、221.6、141.8 mg·g-1，回收率达90.04%。其中的甘露糖或许与榆树皮具有利水、通淋等功能相关联。