石菖蒲α-细辛醚对Lithium-Pilocarpine癫痫模型GABA系统的调控作用

苗静琨，陈启雄，吴小玫，张晓萍

(重庆医科大学附属儿童医院新生儿科，儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室，儿科学重庆市重点实验室，重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地，重庆400014)

在前期研究中我们已经证实石菖蒲α-细辛醚对多种实验性癫痫模型具有确切抗癫痫作用，但其作用机制尚待阐明［1－2］。兴奋性神经递质与抑制性神经递质作用的失平衡是癫痫发生的基本机制，γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)是中枢神经系统(Central nervous system，CNS)内最具有代表性的抑制性神经递质，介导大约30% ～40%CNS神经元的功能，CNS中GABA含量降低是神经细胞过度兴奋，诱发同步放电，产生癫痫发作的重要原因之一［3］。因此，我们采用Lithium-Pilocarpine模型研究了石菖蒲α-细辛醚治疗对GABA系统的调控作用，以期从分子水平探讨石菖蒲α-细辛醚抗癫痫作用的可能机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器α-细辛醚，爱生药业(沈阳)有限公司生产;Lithium、Pilocarpine购自 Sigma公司;GAD67免疫组化试剂盒、GABAAR原位杂交试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司，其他试剂均为国产分析醇。氨基酸分析仪为日立L-8800氨基酸自动分析仪，紫外分光光度计为美国Beckman公司DU-7500型。

1.2实验动物分组及给药♂Wistar大鼠，体质量200～250 g，购自第三军医大学大坪医院野战外科研究所。随机分为正常对照组、模型对照组、α-细辛醚治疗组(100 mg·kg－1)等3组。各组又分为癫痫持续状态(Status epilepticus，SE)后 12、24、48、72 h及1周等5个亚组。给予匹罗卡品前60 min，α-细辛醚治疗组给予α-细辛醚100 mg·kg－1，正常对照组、模型对照组给予同等剂量的生理盐水。

1.3建立Lithium-Pilocarpine癫痫模型参照Celine Dube方法加以修改［4］。腹腔注射匹罗卡品后，实验大鼠出现强直－阵挛持续状态，即癫痫持续状态(Status epilepticus，SE)。具体方法:腹腔注射氯化锂 160 mg·kg－1，18 h ～24 h 后，腹腔注射匹罗卡品 40 mg·kg－1，观察 120 min，出现 SE 1 h 后腹腔注射安定4 mg·kg－1，以降低死亡率。凡SE持续时间未达标准或中途死亡者均从本实验中排除。1.4海马组织GABA含量测定分别于SE后12、24、48、72 h及1周等时相处死实验大鼠各10只，取双侧脑组织，冰盘上分离海马，放入组织匀浆器内，按50 mg wwt·ml－1比例加入冰冷的质量分数为10%的磺基水杨酸，充分研磨，制成质量浓度为5 g·L－1的组织匀浆，4℃，20 000 r·min－1冷冻离心10 min，分离上清，采用日立L-8800氨基酸自动分析仪检测GABA含量。

1.5谷氨酸脱羧酶(GAD67)免疫组织化学检测分别于SE后各时相，腹腔注射质量分数为1%的戊巴比妥钠50 mg·kg－1，麻醉后暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，快速灌注PBS 250 ml，随后灌注质量分数为4%的多聚甲醛/0.1 MPBS液500 ml进行内固定，分别取前囟前2.0至4.0 mm处含额叶及前囟后4.0至6.0 mm处含海马的脑组织，质量分数为25%的蔗糖液中过夜，次日做冠状冰冻切片，厚度为8～10 μm，室温放置30 min后，入4℃丙酮固定10 min，PBS洗5 min×3次备检。以常规SP法进行免疫组化检测，联苯二胺(DAB)显色，苏木精复染，光镜下观察。以PBS取代一抗作为阴性对照。结果判断:细胞质和(或)细胞核呈棕黄色为GAD67阳性反应。以Tiger920图像分析系统检测切片阳性平均光密度(Average optical density，AOD)。每只大鼠取切片3张，在统一放大倍数(×100)及同一光强度下分析额叶、海马CA1、CA3区阳性平均光密度。

1.6γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)活性的检测分别于SE后各时相处死实验大鼠各10只，分离双侧海马及额叶组织，放入组织匀浆器中，加入10倍冰冷的匀浆缓冲液充分匀浆后 8 000 r·min－1，4℃离心15 min，收集上清液，取匀浆上清样品30 μl，另以匀浆缓冲液30 μl设立对照，加入570 μl pH 8.75的焦磷酸钠缓冲液，30℃保温15 min，紫外分光光度计340 nm比色测吸光度。

1.7GABAAR-mRNA原位杂交检测分别于SE后各时相，腹腔注射质量分数为1%的戊巴比妥钠50 mg·kg－1，成功麻醉后立即分离脑组织，液氮过夜，次日做冠状冰冻切片，厚度8～10 μm，入4℃含1/1 000质量分数为4%的多聚甲醛/0.1 MPBS中，室温固定20 min，0.02 mol·L－1PBS(pH 7.2，Rnase free)漂洗5min×3次，体积分数为0.3的H2O21份+甲醇50份混合，室温孵育30 min，滴加质量分数为3%的柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，室温消化10 s，用含有1/1000的质量分数为4%的多聚甲醛/0.1 MPBS室温固定10 min，每张切片加预杂交液20 μl，恒温箱内(38～42)℃孵育2 h，每切片加杂交液(探针)20 μl，恒温箱内(38 ～42)℃孵育过夜，滴加封闭液，37℃孵育30 min，滴加生物素化鼠抗地高辛抗体，37℃ 孵育 60 min，滴加 SABC，37℃ 孵育 30 min，滴加生物素化过氧化物酶，DAB显色，苏木精复染，光镜下观察。以PBS取代探针作为阴性对照。结果判断及图像分析同前。

1.8统计学分析所有数据均以±s表示，采用SPSS 10.0统计软件，根据方差齐性与否分别用参数检验和非参数检验，方差齐性资料单因素多均数比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用t检验，非齐性资料采用秩和检验。

2 结果

2.1石菖蒲α-细辛醚治疗对Lithium-Pilocarpine模型海马GABA含量的影响模型组大鼠SE后各时相海马GABA含量均明显降低，且持续至SE后72 h，之后缓慢增高，至SE后1周接近正常水平，与正常对照组相比，差异有显著性(P＜0.01)。石菖蒲α-细辛醚治疗能明显增加大鼠SE后各时相海马GABA含量(P＜0.05)，表明石菖蒲α-细辛醚可通过明显增加海马GABA含量，从而发挥抗癫痫作用，见 Tab 1。

Tab 1 GABA content in Hippocampus of the Lithium-Pilocarpine models after treated with alpha-asarone(nmol·g－1wet tissue，n=10)

2.2石菖蒲α-细辛醚治疗对Lithium-Pilocarpine模型GAD67表达的影响模型组大鼠SE后12 h～72 h海马及额叶GAD67的表达较正常对照组明显降低，差异有显著性(P＜0.05)，其中以SE后12 h GAD67的表达下降最为明显，SE后1周，海马及额叶GAD67的表达逐渐增加，并接近正常水平。而石菖蒲α-细辛醚治疗组大鼠各时相脑内GAD67表达增强，并持续数日以上。在SE后12 h～72 h，石菖蒲α-细辛醚治疗组海马及额叶GAD67表达均明显高于模型组大鼠 (P＜0.05)。石菖蒲α-细辛醚能增加脑内GAD67表达以增加GABA合成，提高脑内GABA含量，从而发挥抗癫痫作用，见Tab 2。

2.3石菖蒲α-细辛醚治疗对Lithium-Pilocarpine模型大鼠γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)活性的影响模型组大鼠SE后各时相脑内存在极高的GABA-T活性，与正常对照组相比，差异有显著性(P＜0.05);以海马区的GABA-T活性增高最为突出。石菖蒲α-细辛醚治疗使大鼠脑内GABA-T活性在SE后各时相点均有明显而持续降低(P＜0.05)，有助提高脑内GABA含量，控制癫痫发作;通过脑区间比较，石菖蒲使海马区GABA-T活性的下调作用明显强于额叶，差异有显著性(P＜0.05)，见Tab 3。

2.4石菖蒲α-细辛醚治疗对Lithium-Pilocarpine模型GABAAR-mRNA表达的影响模型组大鼠SE后12 h～24 h脑内GABAAR-mRNA表达明显降低，与正常对照组相比，差异有显著性(P＜0.05)。模型组大鼠脑内GABAAR-mRNA表达高峰主要发生在SE后48 h～72 h;海马区GABAAR-mRNA表达持续高于额叶 (P＜0.05);石菖蒲α-细辛醚能明显增强SE后各时相点大鼠海马与额叶GABAAR-mRNA表达(P＜0.05)，见Tab 4。

3 讨论

Lithium-Pilocarpine模型是目前应用最多的癫痫模型之一，该模型SE所导致的海马神经元丢失、苔藓纤维丝状芽生，以及突触重建正是癫痫自发性发作的组织病理学基础［6］。实验大鼠行为学改变与脑电图异常放电同步，模型建立后能维持较长时间的反复癫痫发作，因而被认为是当前研究癫痫较实用的一种动物模型［7］。

Tab 2 AOD of GAD67 immunoreactivity in brain of Lithium-Pilocarpine models after treated with alpha-asarone(ODu/mm2，n=10)

GABA是CNS内最具有代表性的抑制性神经递质，一般认为CNS中GABA含量降低是神经细胞过度兴奋，诱发同步放电，产生癫痫发作的重要原因之一［3，5］。GABA 是由脑内谷氨酸经 GAD 脱羧而成，GAD是GABA合成的限速酶，直接影响脑组织中GABA含量，在脑组织中的分布与GABA能神经元基本一致，被视为GABA能神经元的直接标志物［8］。GABA分解代谢首先由 GABA-T将氨基除去、生成琥珀酸半醛(SSA)，后者再经琥珀酸半醛脱氢酶氧化成琥珀酸，参与三羧酸循环，GABA-T是催化GABA生成SSA的关键酶，其活性高低直接影响到GABA的水平［9］。GABA通过GABA受体发挥抑制性作用，GABAA受体与癫痫关系最为密切，兴奋GABAA受体能抑制癫痫发作，抑制GABAA受体则会诱发癫痫［10］。

Tab 3 GABA-T activity in brain of Lithium-Pilocarpine models after treated with alpha-asarone(nmol·mg－1Pro·min，n=10)

Tab 4 AOD of GABAA-RNA in brain of Lithium-Pilocarpine models after treated with alpha-asarone(ODu/mm2，n=10)

在前期研究中我们已经证实石菖蒲α-细辛醚在Lithium-Pilocarpine实验大鼠模型中具有确切抗癫痫作用［1］。本研究中我们通过观察Lithium-Pilocarpine模型大鼠GABA含量、GAD67表达、GABA-T活性及GABAA受体表达的动态变化及α-细辛醚治疗的影响，探讨α-细辛醚抗癫痫作用的可能机制。结果表明，模型大鼠SE后各时相海马GABA含量均明显降低，且持续至SE后72 h，之后缓慢增高，至SE后1周始接近正常，与对照组相比，差异有显著性(P＜0.05)，证实CNS中GABA介导的抑制性神经功能减弱在癫痫发生中起着重要作用;SE后12 h～72 h海马GAD67表达较对照组明显降低(P＜0.05)，其中以SE后12 h GAD67表达下降最为明显;SE后各时相脑内存在极高的GABA-T活性，表明GABA-T活性增高，可能是Lithium-Pilocarpine模型脑内GABA含量降低的重要原因之一;SE后12 h～24 h脑内GABAAR-mRNA表达降低，差异有显著性(P＜0.05)。GABAAR-mRNA表达高峰主要发生在SE后48 h～72 h，此与SE后脑内GABA含量逐步回升，抑制性递质系统功能渐有增强的步伐一致。

石菖蒲α-细辛醚治疗能明显增加Lithium-Pilocarpine模型大鼠SE后各时相海马GABA含量(P＜0.05);能增强SE后各时相脑内GAD67表达(P＜0.05)，并持续数日以上;能明显而持续地降低SE后各时相点增高的GABA-T活性，进一步抑制GABA分解代谢，从而上调CNS内GABA含量;能明显增强SE后各时相点大鼠海马与额叶GABAAR-mRNA表达(P＜0.05)。

综上所述，我们认为在Lithium-Pilocarpine诱导的癫痫大鼠中，海马GABA系统的抑制功能减弱是癫痫产生和发展的关键因素。石菖蒲α-细辛醚可能通过抑制GABA-T活性以降低GABA分解代谢，上调GAD67表达使GABA合成增加，上调GABAA受体表达以增强GABA介导的抑制功能从而发挥抗癫痫作用。今后需要进一步研究石菖蒲α-细辛醚对Lithium-Pilocarpine模型慢性期GABA系统的调节，以期能更准确揭示其可能的机制。

(致谢:感谢重庆医科大学附属儿童医院中医科张茂教授在本研究中给予的技术支持和帮助。)

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