宁神补心片质量标准研究＊

王孟良，赵佳丽，宋珍鹏，于慧娜，赵 莉

(河南省新乡市食品药品检验所，河南 新乡 453000)

宁神补心片收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂(第二十册)》，由丹参、五味子、地黄、首乌藤、合欢皮等10味药材组成，具有养血安神、滋补肝肾之功效，用于肝肾阴血不足所致的头昏、耳鸣、心悸、健忘、失眠等症。原标准中收载有丹参的薄层色谱鉴别，本标准为更好地控制产品质量，笔者增加了五味子、首乌藤、熟地黄、合欢皮的薄层色谱鉴别和方中君药丹参活性成分丹酚酸B的含量测定。现报道如下。

1 仪器与试药

LC2010CHT型高效液相色谱仪(岛津公司);92SM－202A－DR型电子天平(瑞士);Transilluminator 2020D型紫外透射仪。丹酚酸B 对照品(批号为 111562－200706，纯度为 96.0%)，5－羟甲基糠醛对照品(批号为111626－200906)，五味子甲素对照品(批号为110764－200708)，大黄素对照品(批号为0756－200211)，五味子、首乌藤、合欢皮对照药材均购自中国药品生物制品检定所;熟地黄(本所鉴定合格的药材);宁神补心片(多厂家提供)。阴性样品按处方中各药味比例依法制备。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 五味子[1]

取本品20片，除去包衣，加甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL、乙醚15 mL，分次交替溶解，全部转移至分液漏斗中，振摇提取，分取乙醚液，水液加乙醚振摇提取2次，每次15 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺五味子的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。另取五味子对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取五味子甲素对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取供试品溶液和阴性对照品溶液各5 μL、对照药材溶液和对照品溶液各4 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯－乙酸乙酯－甲酸(11 ∶1 ∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液对测定无干扰(见图1)。

2.1.2 熟地黄[1]

取本品10片，除去包衣，研细，加水50 mL，温热使充分溶散，加热至沸，放冷，用脱脂棉滤过，取滤液，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺熟地黄的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。另取熟地黄对照药材1 g，剪碎，加水60 mL，煎煮30 min，放冷，用脱脂棉滤过，取滤液，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。再取5－羟甲基糠醛对照品，制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二甲苯－乙酸乙酯(1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2，4－二硝基苯肼乙醇试液。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液对测定无干扰(见图2)。

图1 五味子薄层色谱图

图2 熟地黄薄层色谱图

2.1.3 首乌藤[1]

取本品20片，除去包衣，研细，加20%硫酸液10 mL，三氯甲烷20 mL，加热回流1 h，放冷，分取三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺首乌藤的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。另取首乌藤对照药材0.25 g，同法制成对照药材溶液。再取大黄素对照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。置氨蒸气中熏后，供试品溶液色谱中，在对照品和对照药材溶液色谱相应位置上显相同的红色斑点，阴性对照品溶液对测定无干扰(见图3)。

2.1.4 合欢皮[2]

取本品10片，除去包衣，研细，加甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加正丁醇20 mL，水浴加热5 min，搅拌使溶解，倾取上清液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺合欢皮的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。另取合欢皮对照药材0.2 g，加甲醇20 mL，超声处理 30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上(点样后，薄层板在干燥器中干燥过夜)，以三氯甲烷 －丙酮 － 甲酸(6∶0.3∶0.2)为展开剂，薄层板预饱和30 min，展开，取出，晾干，喷以5%磷钼酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液对测定无干扰(见图4)。

图3 首乌藤薄层色谱图

图4 合欢皮薄层色谱图

2.2 丹酚酸B含量测定[1]

2.2.1 色谱条件

色谱柱:Phenomenex Gemini C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 －乙腈 －水 －甲酸(30∶10∶59∶1);流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;检测波长:286 nm;进样量:10 μL。理论板数按丹酚酸B峰计算不低于2 000。

2.2.2 溶液制备

取本品10片，糖衣片除去糖衣，精密称定，取约0.7 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加75%甲醇适量，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)30 min，放冷，加75%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取不含丹皮的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液。取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加75%甲醇制成每1 mL含丹酚酸B 60 μg的溶液，即得对照品溶液。

2.2.3 测定波长选择

精密吸取丹酚酸B对照品溶液，注入液相色谱仪(二极管阵列检测器)记录光谱图，图5表明丹酚酸 B在 286.6 nm波长处有最大吸收。参考2010年版《中国药典(一部)》丹参中丹酚酸B的含量测定方法，选取检测波长为286 nm。

图5 丹酚酸B紫外光谱图

2.2.4 方法学考察

专属性试验:取丹酚酸B对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液在286 nm波长处的色谱图，结果表明，对照品溶液及供试品溶液均在保留时间约12 min处有一吸收峰，阴性对照品溶液在相应的位置上无吸收峰，说明阴性对照品溶液无干扰。高效液相色谱图见图6。

图6 高效液相色谱图

线性关系考察:取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加75%甲醇制成每1 mL含65.8 μg的溶液。分别精密吸取上述溶液 2，5，10，15，20，25，30 μL，注入液相色谱仪，以峰面积为纵坐标(Y)、对照品进样量(μg)为横坐标(X)绘制标准曲线，回归方程为Y=1 202 173 X+1 981，r=1.000 0(n=7)。结果表明，丹酚酸 B进样量在0.137 0～2.055 6范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:精密吸取同一对照品溶液，依法重复进样6次。结果的 RSD为0.56%(n=6)。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液，分别在制备后0，6，12，24 h时依法测定。结果的 RSD为0.8%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

加样回收试验:精密称取已知含量的供试品6份，约0.35 g，精密加入一定量对照品溶液，按2.2下项方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率。结果见表1。

表1 丹酚酸B加样回收试验结果(n=6)

检测限和定量限确定:以信噪比3∶1确定，检测限为0.263 μg/mL。以信噪比 10 ∶1 时连续进样 5 次，峰面积 RSD=1.3% 对应的浓度确定，定量限为 0.658 μg/mL。

2.2.5 样品含量测定

取不同生产厂家8批宁神补心片，依法测定。结果批号分别为100601，20090101，100802，09062901，1004251，20100412，20090101，20100101 的产品含量分别为 3.174，1.718，1.556，2.655，2.260，2.567，2.257，2.811 mg/片。

3 讨论

试验过程中，对供试品溶液提取对比了不同溶剂(水和75%甲醇)、提取方法(加热回流和超声)和提取时间(30和60 min)，结果表明75%甲醇超声30 min提取最简便、完全。原标准中仅有丹参酮ⅡA薄层鉴别，文中增加了五味子、首乌藤、熟地黄、合欢皮的薄层鉴别和丹酚酸B的含量测定。方法专属性强，阴性无干扰，可作为该品种的质量控制方法。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:70－905.

[2]国家药典委员会.中药材薄层色谱彩色图集[M].北京:人民卫生出版社，2009:281.