高效液相色谱法检测小肠上皮细胞多胺含量

随晶晶，卢文彪，李茹柳，温 鹏，胡 灿，赵世清，陈蔚文，2

(1.广州中医药大学，广东 广州 510405;2上海市高校中医内科学E-研究院，上海中医药大学，上海 201203)

多胺是一类低分子非蛋白质含氮化合物，主要有腐胺(putrescine，Put)、精脒(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)。它们广泛分布在生物组织内，具有多种生物学功能。多胺对肠粘膜上皮细胞的正常生长发育及损伤后修复发挥着重要作用，是上皮细胞不同功能调节复杂信号通路的中心焦点［1-2］。胃肠上皮细胞构成胃肠粘膜的保护屏障［3］，胃肠粘膜损伤后存在着修复过程，多胺对其修复过程中的细胞迁移、分化、增殖起关键性作用［4］。益气健脾中药可通过鸟氨酸脱羧酶和多胺机制，促进其修复过程中细胞迁移、分化、增殖等环节［5-7］。目前，多采用化学衍生 -高效液相色谱(HPLC)法测定生物样品中的多胺［8］。常见的衍生化试剂有邻苯二甲醛、丹酰氯或苯甲酰氯等，对于苯甲酰氯衍生化条件的考察与优化，以及IEC-6细胞中同时测定腐胺、精脒和精胺的检测方法则未见报道。因此建立苯甲酰氯柱前衍生-高效液相色谱法测定细胞内多胺含量，观察阳性对照药精脒对IEC-6细胞划痕损伤后多胺含量的影响，为病理生理及药理研究中检测该细胞多胺提供参考。

1 仪器与材料

Agilent1200液相色谱系统;3111型CO2培养箱(Thermo公司);Hypersil ODS柱(大连依利特分析仪器有限公司)。

IEC-6细胞(大鼠小肠隐窝细胞，ATCC，Catalog No.CRL-1592，Lot.4988325)。高糖 DMEM(Lot.No.128000-017，GIBCO 公司)、Fetal Bovine Serum(FBS)(Lot.No.7211229，GIBCO 公司);胰酶(Lot.No.2716B052，Ameresco公司)、硫酸庆大霉素(Ameresco公司);胰岛素(Cas.No.11070-73-8，Sigma公司);EDTA2Na·2H2O(广州威佳科技有限公司);腐胺对照品(CAS.No.110-60-1;Lot:S53751459，Sigma公司)、精脒对照品(CAS.No.124-20-9;Lot:0001438791，Sigma公司)、精胺对照品(CAS.No.71-44-3;Lot:1309938，Sigma公司)。色谱甲醇(MERCK公司);超纯水(Mili-Q Integral 3制备);其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1多胺对照品的配制分别精密称取腐胺、精脒、精胺对照品 0.0101 g、0.0189 g、0.0282 g，加色谱甲醇溶解，分别定容于5 ml容量瓶，得腐胺、精脒、精胺浓度分别为 2.29 ×10-2、2.60 ×10-2、2.79×10-2mol·L-1的单一对照品贮备液。分别精密量取3种单一对照品贮备液各1 ml，置于1 L容量瓶中，加色谱甲醇稀释至刻度，得腐胺、精脒、精胺浓度分别为2.29×10-5、2.60 ×10-5、2.79×10-5mol·L-1的对照品混合溶液。

2.2细胞样品前处理待IEC-6细胞生长至80%～90%(培养皿底部80% ～90%面积有细胞生长)时，EDTA-胰蛋白酶消化液消化细胞，制作单细胞悬液，4 ×108cell·L-1种植于6 孔板，每孔2 ml。接种24 h后，吸弃培养液，用1 ml移液器吸头沿孔中央轻轻做一直线划痕，用PBS缓冲液冲洗细胞表面3次以去除细胞残骸和碎片。空白组加入完全培养基每孔2.5 ml cDMEM;精脒组每孔2.5 ml cDMEM(含精脒5 μmol·L-1，简称 SPD组)。每组6个复孔，合并2个复孔的细胞为一个样，即每组3个样。体积分数为0.05的CO2，体积分数为0.95的空气，饱和湿度下37℃培养12 h后，弃废液，PBS冲洗2次，每孔加入胰酶-EDTA消化液0.2 ml，37℃孵育5 min，每孔加入0.2 ml cDMEM终止消化后，转移细胞悬液至1.5 ml EP管。3 000 r·min-1离心5 min，弃上清;加入PBS重悬后3 000 r·min-1离心5 min，弃上清;再次加入1 ml PBS重悬，取10 μl转移至EP管内用于细胞计数，余下细胞悬液3 000 r·min-1离心5 min，弃上清后加入冷高氯酸(体积分数为 0.05)1.2 ml，混匀后 4℃、1 4000 r·min-1离心10 min。取上清液，供衍生化处理。

2.3衍生化处理取待测样品溶液1 ml，分别加入2 mol·L-1的氢氧化钠溶液1 ml和苯甲酰氯5 μl(含量≥96%)，涡旋混合后放置20 min，再加入饱和氯化钠溶液2 ml和氯仿2 ml，涡旋混合1 min，3 000 r·min-1离心 10 min，吸取下层 1.5 ml有机相并氮气吹干。残渣用0.5 ml的流动相溶解在带有螺盖的玻璃管中，50℃下水浴保温8 h，所得溶液分别加入2 mol·L-1氢氧化钠溶液0.2 ml及氯仿2 ml，涡旋混合 1 min，3 000 r·min-1离心 10 min，吸取下层1.5 ml有机相并氮气吹干，残渣用0.5 ml流动相溶解，经0.22 μm有机微孔滤膜滤过，按拟定条件进样测定。

2.4色谱条件及专属性验证ODS-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);检测波长:234 nm;柱温:25℃;流动相 ∶甲醇 ∶水(55∶45);流速:1.0 ml·min-1;进样量:20 μl。在建立的色谱条件下测定，各成分峰分离良好，腐胺、精脒和精胺的保留时间分别为7.2、13.7、27.6 min。细胞样品未加衍生剂和衍生剂未加细胞样品处理后，无相应的色谱峰出现。结果见Fig 1～3。

2.5衍生化温度考察按“2.3衍生化处理”项下方法，考察水浴温度分别为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃时多胺的峰面积。结果见Tab 1。

Fig 1 HPLC chromatogram of polyamines after derivation

Fig 2 HPLC chromatogram of cell sample without derivative reagent

Fig 3 HPLC chromatogram of derivative reagent without cell sample

Tab 1 Polyamines peak areas in different water-bath temperature(x¯±s，n=4)

2.6衍生时间的考察按“2.3衍生化处理”项下方法，考察水浴保温时间分别为 1、2、4、6、8、10、12、14、16 h时的多胺峰面积(n=4)。结果见Fig 4。

Fig 4 Polyamines peak areas in different water-bath time

2.7线性范围取对照品混合液(含腐胺4.80×10-5mol·L-1、精脒 4.065 × 10-5mol·L-1、精胺7.11 ×10-5mol·L-1)1 ml，按“2.3衍生化处理”项下方法处理，分别进样 1、2、5、10、15、20 和 25 μl进行测定，以衍生化前样品溶液浓度折算进样量(10-10mol)与峰面积进行回归，腐胺、精脒和精胺的回归方程分别为^Y=8.2081X-0.5537，r2=0.9996;^Y=7.5388X-0.4558，r2=0.9995;^Y=6.3143X-0.2091，r2=0.9996，腐胺在0.054 ～1.35 nmol、精脒在 0.046 ～1.15 nmol、精胺在 0.080 ～2.00 nmol范围内呈现良好的线性关系。

2.8精密度实验分别精密配制对照品混合液高、中、低3个浓度，高浓度(含腐胺4.80×10-5mol·L-1;精脒4.065×10-5mol·L-1;精胺7.11×10-5mol·L-1);中浓度(含腐胺 3.20 ×10-5mol·L-1;精脒2.71 ×10-5mol·L-1;精胺 4.74 ×10-5mol·L-1);低浓度(含腐胺1.60×10-5mol·L-1;精脒1.355×10-5mol·L-1;精胺 2.37 ×10-5mol·L-1)。按“2.3”项下方法处理，测定峰面积，日内精密度:高、中、低浓度样品各制备5份，当日测定1次;日间精密度:高、中、低浓度样品每隔24h测定1次，共测定3次。结果见Tab 2，3。

Tab 2 The intra-day precision of polyamines(n=5)

Tab 3 The inter-day precision of polyamines(n=5)

2.9回收率实验分别精密配制对照品混合液高、中、低3个浓度(同“2.8”项下)，按“2.3”项下方法处理，测定，用标准曲线计算。结果见Tab 4～6。

Tab 4 The method recoveries of putrescine(n=6)

Tab 5 The method recoveries of spermidine(n=6)

Tab 6 The method recoveries of spermine(n=6)

2.10细胞样品测定细胞样品按“2.2”和“2.3”项下方法处理，测定。结果见Tab 7。

Tab 7 The polyamines contents in cell cultivated with spd.for 12 h(±s，n=3)

Tab 7 The polyamines contents in cell cultivated with spd.for 12 h(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control

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3 讨论

多胺的衍生化条件考察结果表明，温度对多胺的苯甲酰化影响较大，40℃时精脒和精胺测定结果的重复性较差，原因尚不明确，可能与该温度下较有利于多胺之间的酶促转化有关［2］;而在60℃时，副反应增加，主要表现为对腐胺色谱峰分离度的影响，干扰测定。测定的多胺峰面积随样品的衍生化时间而变化较大，8 h时出现峰值，随后又下降，这可能是多胺与苯甲酰氯之间的副反应造成的，确切原因还有待深入研究。综合考虑，选用50℃为衍生化温度、8 h为衍生化时间。

方法学考察和细胞样品测定结果表明，建立的多胺(腐胺、精脒和精胺)含量测定方法具有较好的准确性，且较灵敏、简便，可作为细胞中多胺的分析检测方法用于研究多胺对小肠上皮细胞增殖、迁移、分化、凋亡等方面的影响，以及研究药物通过对多胺影响而发挥的药理作用等方面。

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