黄芪多糖丹参酮对慢性心衰大鼠MIF表达的调控作用

杨志霞，林 谦，马 利，孙中成，李斐斐，李根茂，葛冬宇

(1.北京中医药大学东方医院心内科，北京 100078;2.北京中医药大学研究生院，3.北京中医药大学基础医学院，北京 100029)

心力衰竭是心血管疾病的主要死因。心脏的自身神经-内分泌-能量代谢-免疫网络调节可能是心衰时心室扩大和功能异常的重要机制。CHF时存在细胞因子网络的紊乱。近年来发现MIF作为前炎症细胞因子，可诱导T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)产生 IFN-γ，促进 TNF-α、IL-6 和粒-单集落刺激因子(GM-CSF)等炎性因子的表达，通过抑制心肌收缩力，引起心肌重塑及心肌细胞凋亡，是导致心衰发生的一个新的炎性指标［1］。《黄帝内经》记载:“正气存内，邪不可干，邪之所凑，其气必虚。虚久必瘀”。本课题基于气虚血瘀导致心衰的理论，探索益气活血中药的单体提取物—黄芪多糖联合丹参酮对CHF关键性炎性细胞因子TNF-α、IL-6的上游调控因子——MIF的干预效应，为临床治疗CHF探索新思路新方法。

1 材料与方法

1.1材料与试剂丹参酮Ⅱ-A(上海第一生物制药厂，批号100603);黄芪多糖(广东惠州东方植物科技有限公司);阿托伐他汀片(德国辉瑞制药有限公司，批号J20070060);PCR引物(大连宝生物工程);逆转录试剂盒(美国 Qiagen公司);Rat MIF(RB公司，批号3R069);TNF-α、IL-6双抗体夹心ELISA试剂盒(北京四正柏生物科技公司);切片机(LEITZ WETZLAR GERMANY 1516);显微镜(日本Olympus);照相系统(801.Nikon eclipse);IS-ElementsBR2.0图像分析系统(日本Nikon公司);PCR仪(Bioer XP CycleC);Transiliuminator凝胶成像仪;全自动多功能酶标仪(506000001，SAFIREⅡ);电热恒温培养箱(DH4000A，天津泰斯特);半自动洗板机(Thermo，USA)。♂ SD大鼠，体质量(200±50)g，由北京维通利华实验动物中心提供。

1.2慢性心衰大鼠模型的建立采用冠状动脉结扎术方法［2］:麻醉固定备皮后行气管插管连小动物呼吸机，行正压人工呼吸(潮气量7～8 ml，呼吸频率80次·min-1)，并描记大鼠正常心电图。消毒后，沿胸骨左侧第3、4肋间隙开胸，用眼科小镊子轻提并剪开心包膜，暴露心脏用无菌齿镊轻提左心耳，暴露主动脉根部，线绕过冠状动脉(心上缘)结扎心肌组织2～3 mm，打2个死结，以缝线下心肌色泽变浅、苍白，同时心电监护见肢导R波振幅及ST段明显升高，为结扎成功。缝合胸壁，皮下注射青霉素80万IU、速尿0.2 ml、利多卡因0.2 ml，待恢复自主呼吸后撤离呼吸机。

1.3一般观察及超声心动图检查术后4 h常规饲养食水。第2周饲料减半。第3周游泳20 min·(次·d)-1。第4周麻醉后备皮，大鼠取仰卧位。应用VEVO7.0超声显像仪行超声多普勒心电图检查，将成模大鼠纳入实验组。

1.4实验分组及给药方案将成模后大鼠分为模型组、黄芪多糖组(APS，3 g·kg-1·d-1)、丹参酮组(Tan，5 mg·kg-1·d-1)、黄 + 丹组(剂量同上)、阿托伐他汀组(Atorvastatin，10 mg·kg-1·d-1)及假手术组(Sham)，各给药组分别给予相应体积的药物，连续给药6 wk。

1.5心肌病理形态学检查大鼠活杀后开胸剪下心脏，取心尖部心肌，以4℃冷生理盐水冲洗干净。用4%多聚甲醛溶液固定。组织固定48 h后常规脱水、石蜡包埋，6 μm间断连续切片、HE染色，光镜下观察。

1.6RT-PCR法检测心肌MIFmRNA取50～100 mg左心室心肌组织匀浆，TRIzol抽提总RNA，紫外分光光度计测定浓度及纯度。4 μl RNA加到12.5 μl反转录反应体系中，按RT-PCR试剂盒说明书操作合成 cDNA。1 μl cDNA、0.5 μl引物加入到20 μl扩增反应体系中，使用PCR扩增仪合成DNA。见Tab 1。

Tab 1 PCR reaction program

产物长度 Rat Actin 380 bp，Rat MIF 406 bp。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色、照相并经光密度仪扫描分析，以Actin灰度值进行标准校正，计算MIF产物相对量。

1.7ELISA法检测血清MIF、TNF-α及IL-6水平麻醉后大鼠腹主动脉取血，干净促凝管中室温凝固0.5 h后1 000×g离心15min，收集血清并分装。按ELISA试剂盒说明书操作检测血清MIF、TNF-α及IL-6水平。

1.8统计学分析应用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料用±s表示，组间差异比较采用one-way ANOVA，同时应用两两比较(SNK检验)。

2 结果

2.1心肌病理形态学检查结果HE染色光镜下显示:假手术组可见心肌细胞核横纹，未见变性、坏死细胞浸润，心内膜及心外膜未见明显异常(Fig 1A);模型组可见室壁局部不规则坏死灶，心肌纤维数量减少，残余心肌染色变浅，横纹模糊，部分坏死灶已被胶原纤维所构成的瘢痕组织替代，间质内有较多炎细胞浸润，在心肌纤维之间有大量结缔组织增生(Fig 1B);药物组可见坏死灶内心肌纤维数量减少，残余心肌细胞比模型组多，横纹清晰，部分坏死灶已被胶原纤维的瘢痕组织替代，间质内有少量炎细胞浸润(Fig 1C～F)。

2.2RT-PCR法检测心肌MIF mRNA表达情况心肌组织PT-PCR结果显示，各治疗组心肌MIF mRNA表达较模型组均明显降低，RT-PCR电泳产物灰度比值为:假手术组(0.410±0.105)，阿托伐他汀组(0.532±0.128)，黄 +丹组(0.621±0.123)，黄芪多糖组(0.720±0.205)，丹参酮组(0.795±0.188)，模型组(0.911±0.232)。模型组与假手术组，黄+丹组与黄芪多糖组、丹参酮组相比差异均有统计学意义(P均＜0.05)。见Fig 2，3。

Fig 1 Histopathology of left ventricular in CHF rats(×40)

Fig 2 Expression of myocardial MIFmRNA by RT-PCR detection

Fig 3 Expression of myocardial MIFmRNA by RT-PCR detection

2.3 ELISA 法检测血清 MIF、TNF-α、IL-6 表达的影响结果显示，各治疗组血清 MIF、TNF-α、IL-6的表达较模型组均明显降低，而模型组与假手术组，黄+丹组与黄芪多糖组、丹参酮组相比差异均有统计学意义(P均＜0.05)。见Tab 2。

Tab 2 Expression of serum MIF，TNF-α，IL-6 expression by ELISA detection(x¯±s，n=5)

3 讨论

心力衰竭是大多数心血管疾病的最终归宿，也是最主要死因［3］。血清 IL-6、TNF-α的水平与心血管危险因素患者的生命衰竭有关［4］，可能通过下调肌浆网Ca2+-ATP酶，推迟舒张心肌细胞钙离子的再吸收和衰减，导致心脏舒张功能不全［5］。活性氧可引起氧化应激诱导MIF分泌，损伤心肌细胞［6］，推测MIF可能在急性心肌梗死后心功能不全和心室重构中发挥作用［7］。MIF可诱导巨噬细胞分泌TNF-α，抑制神经体液兴奋和心肌收缩力［8］。因此，MIF现已成为多种炎症介质和细胞因子基因表达调控的关键因子。

《本草纲目》记载黄芪为补药之长，黄芪多糖是其主要有效活性成分，可通过抑制人心脏微血管内皮细胞的NF-κB信号通路，减少炎症细胞因子的表达［9］。丹参酮Ⅱ-A是丹参的主要有效成分，其抑制血小板黏附、聚集及血栓形成的作用，可能与其抑制肌动球蛋白激活的Mg2+-ATP酶活性有关［10］。他汀类药物具有多重心血管保护作用，能有效抑制心肌肥厚及心室重构，延缓心衰整个病程［11］。本实验采用黄芪多糖联合丹参酮对CHF大鼠细胞因子的活化进行干预，通过病理组织学、RF-PCR法及ELISA法，证实益气活血中药对大鼠心肌组织MIF活化及血清MIF、TNF-α、IL-6表达均具有明显的治疗作用，且疗效优于单一用药组，其作用机制可能与抑制基因表达、细胞生长及凋亡，阻断左室重构，从而延缓心衰发生发展有关，中西医结合从心衰-气虚血瘀证-免疫调节-细胞因子网络调控的角度，进行多层次多靶点的干预，针对抗MIF活化的免疫调节中药有望成为CHF治疗新靶点。

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