融合蛋白GGH在小鼠体内的药效学评价

范 翰，李现丽，窦文芳，杜 斌，邱丽颖，金 坚，许正宏

(江南大学医药学院，江苏 无锡 214122)

近年来糖尿病发病率呈逐年上升趋势，其无法根治的原因是缺乏有效修复β细胞功能的药物，GLP-1因能促胰岛素释放和促胰岛细胞增殖而成为该领域的研究热点。但是GLP-1在体内的半衰期极短，目前研究主要集中在以GLP-1为基础的分子衍生物［1-2］上，现已有部分长效药物被批准用于临床［3-4］。该研究前期利用分子生物学手段，将GLP-1突变体GLP-1A2G两分子串联后和人血清白蛋白(HSA)融合构建长效融合蛋白GGH［5］，并对其进行分离纯化［6-7］。后期筛选和建立了一种β细胞轻度损伤模型，用于GGH及近年来新兴的促β细胞增生类融合蛋白药物疗效的快速筛选、评价及作用机制的初步探讨。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器STZ，Sigma公司;GLP-1单体，上海强耀生物工程公司;HSA，湖南紫光古汉南越制药有限公司;Ex-4，Sigma公司;融合蛋白GGH，江南大学制药工程实验室(HPLC检测纯度＞95%);碘［125I］胰岛素放射免疫分析药盒，北京市福瑞生物工程公司;小鼠增殖细胞核抗原(PCNA)抗体，链霉亲和素-过氧化物酶(SABC)及DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。Freestyle血糖仪及检测试纸条，美国雅培有限公司;冷冻离心机，日本Hitachi公司;Wizard 1470γ自动计数仪，美国Perkin Elmer仪器公司;切片机，德国特莱富公司。

1.2β细胞轻度损伤模型的建立健康♂C57BL/6小鼠16只，16～18 g，SPF级，由中国科学院上海实验动物中心提供〔SCXK(沪)2007-0005〕。按体质量随机分为NC组和STZ实验组，每组8只，实验前禁食14～16 h，次日尾静脉取血测定FBG，实验组单剂量腹腔注射STZ 120 mg·kg-1，之后每周测定FBG，实验观察期为5周，实验结束后摘取胰腺制备石蜡切片行HE染色。d 14的FBG在10～20 mmol·L-1且实验结束时恢复到正常水平的为成功β细胞轻度损伤模型，“成模率/%=成模小鼠只数/造模小鼠只数”，“恢复率/%=血糖恢复的小鼠只数/成模小鼠只数”。

1.3融合蛋白GGH的降糖药效评价另70只C57BL/6小鼠腹腔注射STZ造模，14 d后将56只成模小鼠纳入统计范围，按FBG分为7组，每组8只:模型对照组(DM)、GLP-1对照组(0.07 mg·kg-1)、HSA对照组(2 mg·kg-1)、Ex-4 阳性对照组(0.1 mg·kg-1)、GGH 低、中、高剂量组(2、6、18 mg·kg-1，GGH 2、GGH 6、GGH 18)，并设 NC 组。每天1次皮下注射，连续治疗2周。每周1次禁食12 h测定FBG;实验结束前1天小鼠进入代谢笼，记录饮食、饮水、尿量和体重变化数值;实验结束后，小鼠眼眶静脉丛取血，收集血清样本，测定血清胰岛素水平;对胰岛细胞做PCNA免疫组化，每张切片上、下、中、左、右处各选取1个胰岛，共5个胰岛，在400倍视野中计数阳性细胞，取平均值。

1.4统计学处理所有实验数据均以±s表示，用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理，两组比较采用t检验。

2 结果

2.1β细胞轻度损伤模型的建立STZ组d 14时成模率为88%，d 35时血糖均值与NC组比较差异无显著性，恢复率为86%，见Fig 1。胰岛HE染色，见Fig 2。d 14时NC组:胰岛结构清晰，边缘清楚，细胞排列整齐，胞质丰富;STZ组:胰岛结构较清晰，边缘模糊，细胞分布较不均匀，细胞数目略有减少，说明给予STZ后引起了胰岛结构的轻度损伤，d 35时STZ组胰岛自我修复较好，形态与NC组接近。故单剂量给药STZ 120 mg·kg-1时C57BL/6小鼠成模率高，恢复率好，为下一步研究融合蛋白GGH降糖效果的理想模型。

2.2融合蛋白GGH的降糖药效评价

2.2.1GGH对C57BL/6模型小鼠饮食、饮水、尿量和体重的影响见Tab 1。GGH低剂量组d 14时与DM、GLP-1、HSA组比较饮食量、饮水量减少(P均＜0.05)，GGH中、高剂量组饮食量、饮水量和尿量减少(P均＜0.05)，GGH高剂量组饮食量、饮水量和尿量与Ex-4组比较差异无显著性(P均＞0.05);GGH各治疗组体质量d 14时与3组对照比较差异均无显著性(这可能与C57BL/6小鼠的体重增长缓慢有关)，与NC组比较均降低(P均＜0.05)。表明GGH在治疗期内对模型小鼠的“三多一少”症状有明显改善，然而恢复到正常水平可能仍需要更长的时间。

Fig 1 Effect of STZ single administration on FBG level in C57BL/6 mice(±s，n=8)

Fig 2 Effect of STZ single administration on islet cells in C57BL/6 mice(HE×400)

Tab 1 Effect of GGH on diet，drinking water，urine volume and body weight in C57BL/6 models in two hours(±s，n=8)

Tab 1 Effect of GGH on diet，drinking water，urine volume and body weight in C57BL/6 models in two hours(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs NC;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs DM，GLP-1，HSA;#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ex-4

Group Diet/g·(10 g)-1 Drinking/ml·(10 g)-1 Urine/ml·(10 g)-1Weight/g NC 0.09±0.03 0.14±0.03 0.21±0.09 23.6±1.07 DM 0.48±0.06 1.67±0.20 1.38±0.17 22.0±1.24 GLP-1 0.47±0.04 1.75±0.31 1.30±0.17 22.2±0.88 HSA 0.49±0.05 1.70±0.28 1.25±0.14 21.2±1.47 Ex-4 0.39±0.10 0.69±0.13 0.45±0.12 22.1±0.57 GGH 2 0.40±0.08＊＊△# 1.37±0.36＊＊△## 1.08±0.34＊＊## 22.1±0.64＊＊GGH 6 0.37±0.12＊＊△ 1.25±0.39＊＊△## 0.99±0.20＊＊△△## 22.4±0.96*GGH 18 0.26±0.12＊＊△△ 0.73±0.15＊＊△△ 0.53±0.19＊＊△△ 22.3±0.94*

2.2.2GGH治疗期内对C57BL/6模型小鼠FBG的影响d 7或d 14时，GGH中、高剂量组与DM、GLP-1、HSA组比较，可明显降低血糖浓度(P均＜0.01)，GGH高剂量组与Ex-4组降糖效果比较差异无显著性 (P均＞0.05)，d 14时GGH高剂量组与Ex-4组血糖浓度基本恢复到正常值范围。表明GGH的降糖效果较好，高剂量组与阳性对照组接近。见Fig 3。

Fig 3Effect of GGH on FBG level of C57BL/6 model mice(±s，n=8)

2.2.3GGH治疗14 d后对C57BL/6模型小鼠FINS的影响d 14时GGH中、高剂量组FINS水平较DM、GLP-1、HSA组明显升高(P均＜0.05)，GGH高剂量组与NC组、Ex-4组比较差异无显著性(P均＞0.05)。表明皮下注射GGH后可通过刺激胰岛素分泌而降低血糖浓度。见Tab 2。

Tab 2 Effect of GGH on FINS and the proliferation of islet cells in C57BL/6 models(¯x ± s，n=8 or 5)

2.2.4免疫组化染色增殖细胞核抗原(PCNA)与其特异性的抗体结合后呈现棕黄色颗粒，PCNA免疫染色基本完全着色于细胞核上，表现为弥散或颗粒形式或二者兼有，见Fig 4。NC组核内着色较浅，这是因为正常状态下处于动态平衡中的β细胞更新较少［8］;GGH中、高剂量组核内棕黄色颗粒含量较丰富，着色较深，阳性细胞比例明显高于NC、DM、GLP-1组(P均 ＜0.05，Tab 2);GGH 中、高剂量组与Ex-4组比较差异无显著性(P＞0.05，Tab 2)。这一结果与 FBG、FINS一致，表明融合蛋白GGH可以通过促进β细胞的增殖和胰岛素的分泌而降低模型小鼠的高血糖水平。

Fig 4 Effect of GGH on PCNA immunohistochemistry of islet cells in C57BL/6 models(SABC×400)

3 讨论

GLP-1是一种生理性肽类肠道激素，它与胰岛β细胞上特异性的受体(GLP-1R)结合后，能够提高β细胞对葡萄糖的敏感性，刺激β细胞中葡萄糖依赖的胰岛素分泌，而且动物实验表明GLP-1可以促进胰岛新生［9］。但是，机体本身产生的活性GLP-1极易被降解，为了提高GLP-1的生物活性，实现其在体内的长效作用，该研究前期利用白蛋白融合技术和基因工程手段，将GLP-1突变体GLP-1A2G两分子串联后和HSA进行融合表达胞外分泌融合蛋白GGH，初步药代动力学显示小鼠体内吸收半衰期为26.6 h，消除半衰期为 57.8 h［6］，克服了其易降解的缺点，然而是否保留天然GLP-1的功效还有待于证实。

为快速评价促β细胞增生类融合蛋白药物的药效及初步研究此类药物的作用机制，参考糖尿病模型化学药物的造模方法［10］，利用STZ轻度损伤小鼠胰岛β细胞，使机体内早期(1～2周)胰岛素分泌不足，血糖值持续稳定升高(2～4周)，后期(4～5周)通过胰岛功能的自我修复使血糖水平恢复正常，从而建立可逆β细胞损伤模型，这在其他文献中尚未见报道。由于此模型小鼠的血糖浓度为一动态变化过程，因此选择血糖水平维持较高的时段(2～4周)作为治疗期，观察GGH给药后是否有更好的降糖效果或者是否缩短受损β细胞的修复时间，以此来评价GGH的降糖药效。我们从2009年10月～2010年7月对小鼠进行β细胞轻度损伤造模筛选，结果发现♂C57BL/6小鼠单剂量腹腔注射STZ 120 mg·kg-114 d的成模率最高为88%，35 d的恢复率最好为86%，这为下一步研究融合蛋白GGH的降糖药效提供了简便理想的模型。

通过14 d治疗发现，GGH治疗组在饮食、饮水、尿量方面有明显的减少;治疗7 d时GGH高剂量组就已呈现明显的降糖效果，治疗期内与Ex-4组的血糖恢复速度接近，实验结束时两组的血糖恢复时间也明显缩短于3组对照组，这提示短期使用GGH可以达到控制高血糖症状的目的。通过对小鼠FINS的测定及胰岛PCNA免疫组化的半定量表明GGH不仅能够促进胰岛素分泌而且能够促进β细胞增殖，加速受损的β细胞恢复正常，而这正是传统糖尿病治疗药物无法根治糖尿病的症结所在，提示GGH在治疗糖尿病方面有广阔的发展前景。

综上所述，我们认为融合蛋白GGH模拟激活GLP-1R途径发挥作用，即通过改善胰岛细胞功能，增加胰岛素的表达分泌及促进胰岛细胞增殖从而达到降低血糖的目的。由此，GGH在克服了GLP-1易降解缺点的同时保留了其天然功效，这不仅对Ⅱ型糖尿病，而且对Ⅰ型糖尿病也具有肯定的治疗作用，相信不久的将来GGH将会成为新型糖尿病治疗药物中的一员。

［1］Chia C W，Egan J M.Biology and therapeutic potential of GLP-1 in the treatment of diabetes［J］.Drug Discov Today，2005，2(3):295-301.

［2］Matthewsm J E，Stewart M W，De Boever E H，et al.Pharmacodynamics，pharmacokinetics，safety，and tolerability of albiglutide，a long-acting glucagon-like peptide-1 mimetic，in patients with type 2 diabetes［J］.J Clin Endocrinol Metab，2008，93(12):4810-7.

［3］Combettes M M.GLP-1 and type 2 diabetes:phsiology and new clinical advances［J］.Curr Opin Pharmacol，2006，6(6):598-605.

［4］Nielsen L L，Young A A，Parkes D G.Pharmacology of exenatide(synthetic exendin-4):a potential therapeutic for improved glycemic control of type 2 diabetes［J］.Regul Pept，2004，117:77-88.

［5］窦文芳，许正宏，张晓梅，等.重组白蛋白人胰高糖素样肽-1突变体的串联体的融合蛋白在小鼠体内的药代动力学［J］.中国药理学通报，2011，27(1):59-62.

［5］Dou W F，Xu Z H，Zhang X M，et al.Pharmacokinetics and biodistribution of125I labeled rh(GLP-1A2G)2-HSA in mouse following a single subcutaneous injection［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(1):59-62.

［6］陈其亮，窦文芳，雷楗勇，等.重组胰高血糖素样肽-1融合蛋白的纯化及其活性测定［J］.生物技术通报，2008，6:147-51.

［6］Chen Q L，Dou W F，Lei J Y，et al.Purification and identification of recombinant protein rh(GLP-1A2G)2-HSA［J］.Biotechnol Bull，2008，6:147-51.

［7］李现丽，窦文芳，张晓梅，等.融合蛋白(GLP-1A2G)2-HSA的分离纯化及其活性评价［J］.药物生物技术，2010，17(6):487-92.

［7］Li X L，Dou W F，Zhang X M，et al.Purification and identification of the activity of fusion protein(GLP-1A2G)2-HSA［J］.Pharm Biotechnol，2010，17(6):487-92.

［8］Habener J F.Glucagon-like peptide-l agonist stimulation of β-cell growth and differentiation［J］.Curr Opin Endocrinol Diabetes，2001，8:74-81.

［9］Tourrel C，Bailbe D，Lacorne M.Persistent improvement of type 2 diabetes in the Goto-Kakizaki rat model by expansion of the β-cell mass during the prediabetic period with glucagon-like peptide-1 or exendin-4［J］.Diabetes，2002，51(5):1443-52.

［10］高红莉，刘方永，夏作理.实验性糖尿病动物模型的理论研究与应用［J］.中国临床康复，2005，9(3):210-2.

［10］Gao H L，Liu F Y，Xia Z L.Theoretical study and application of experimental diabetic animal models［J］.Chin J Clin Rehabil，2005，9(3):210-2.