复方黄芪金银花颗粒的质量标准研究

翟少钦，曹国文，李成君

(重庆市畜牧科学院兽医研究所，重庆 402460)

复方黄芪金银花颗粒是重庆市畜牧科学院兽医研究所根据中医理论研制的治疗鸡传染性法氏囊病的中药复方制剂。为更好地控制其在生产过程中的质量，对复方黄芪金银花颗粒进行了质量标准的研究，以期为复方黄芪金银花颗粒投入生产进行质量控制提供依据。

1 仪器、对照品及化学试剂

1.1 仪器 超声波清洗机:KQ－3200E型，昆山超声波仪器有限公司;三用紫外仪:ZF－2型，上海安亭电子仪器厂;电子天平:BS25S型，德国赛多利斯仪器有限公司，d=0.01 mg;双光束紫外可见分光光度计:TU－1901型，北京普析通用仪器有限公司;硅胶 G、H板:青岛海洋化工厂分厂，批号20100201、20091211。

1.2 对照品 齐墩果酸对照品:A0117，纯度≥98%(滴定法);绿原酸对照品:A0022，纯度≥98%(HPLC);女贞子对照药材:121041－200302;枸杞子对照药材:121072－200806;黄芪甲苷对照品:A0070，纯度≥98%(HPLC)。均购自中国药品生物制品检定所。

1.3 试剂 所有化学试剂均为分析纯。

2 试验方法

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 女贞子 取本品5 g，加甲醇20 mL，超声处理30 min，冷却，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇－三氯甲烷(3∶2)混合溶液1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺失女贞子的颗粒，同法制成阴性对照溶液。另取齐墩果酸对照品，加乙醇制成1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液3～5 μL、对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷－丙酮－乙酸乙酯(5∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰。置紫外光灯(365 nm)下检视，记录结果。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点［1－3］(图1)。

图1 女贞子薄层鉴别图

2.1.2 枸杞子 取本品6.0 g，研细，加水100 mL，超声40 min，放冷，过滤，取滤液，用乙酸乙酯50 mL提取，分取乙酸乙酯，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取枸杞子对照药材1 g，加水50 mL，超声30 min，放冷，过滤，取滤液，用乙酸乙酯30 mL振摇提取。分取乙酸乙酯溶液，蒸干，残渣加甲醇2 mL，作为对照药材溶液。另取阴性对照样品(缺失枸杞子药材)，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯－三氯甲烷－甲酸(3∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯(365 nm)下观察。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性对照色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上无相同颜色的斑点［1，4－5］(图 2)。

图2 枸杞子薄层鉴别图

2.1.3 金银花 取本品10 g，加三氯甲烷30 mL，超声提取2次，每次20 min，滤过，合并滤液，滤液蒸干，用1 mL乙醇溶解，作为供试品溶液。另取绿原酸对照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为阳性对照品溶液。取缺失金银花的颗粒照上法提取，作为阴性对照溶液。吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶H板上，以乙酸乙酯－甲酸－水(7 ∶2.5 ∶2.5)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光灯下(365 nm)检视，供试品色谱中，在与对照品绿原酸色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照色谱上则无［1，6－7］(图 3)。

图3 金银花薄层鉴别

2.1.4 黄芪 取本品3 g，加50 mL水超声提取40 min，滤液加乙醚提取2次，每次20 mL，乙醚液弃去，水液置水浴上加热挥去醚，放冷，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用1%氢氧化钠试液洗2次，每次40 mL，洗液弃去，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品1 mg，加甲醇2 mL，溶解，作为对照品溶液;取缺失黄芪的颗粒照上法提取，作为阴性对照溶液。吸取供试品溶液、对照品溶液及阴性对照液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水(13∶6∶2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开(展距12 cm)，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，110℃烘干，在紫外光灯(365 nm)下检视，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点［1，8－9］(图4)。

图4 黄芪薄层鉴别图

2.2 绿原酸的含量测定

2.2.1 吸收波长的选择

2.2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品13.00 mg置25 mL容量瓶中，用50%的甲醇溶液溶解定容至刻度作为总储备液。取总储备液2.5 mL定容至25 mL得储备液。分别精密量取储备液2、2.5、3、3.5、4 mL 定容至25 mL，即为标准对照品溶液。

2.2.1.2 供试品溶液的制备 取本品于研钵中研细，精密称取5.0 g，置25 mL容量瓶中，加50%的甲醇溶液20 mL，超声处理30 min，冷至室温，50%的甲醇溶液加至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液5 mL，用50%的甲醇溶液定容至25 mL，摇匀，即为供试液。

2.2.1.3 光谱扫描 取标准品溶液及供试品溶液适量，在200～500 nm波长范围内进行光谱扫描，得最大吸收波长为328 nm。

2.2.2 线性关系考察 取上述不同浓度的标准对照品溶液，摇匀后在328 nm处测定吸光度，以吸光度(A)为纵坐标，以浓度(C)(μg/mL)为横坐标，得直线回归方程:A=0.0053×C －0.0012(r=0.9999，n=5)。结果表明，绿原酸在 42.24 ～84.48 μg/mL范围内具有良好的线性关系(图5)。

图5 绿原酸标准曲线

2.2.3 精密度试验 取总储备液1 mL，用50%甲醇溶液定容至100 mL，在328 nm处测定吸光度，重复5次，相对标准偏差(RSD)为0.382%。

2.2.4 稳定性试验 取同一批样品5份，同法制备，分别在 0、2、4、6、24 h 时在 328 nm 处测定吸光度，计算RSD值。结果RSD=0.733%，表明该方法在24 h内很稳定。

2.2.5 加样回收率试验 取已知含量的供试品0.5 g，精密称定，再精密加入一定量的绿原酸对照品，按供试液的制备方法同法制备，在328 nm处测定吸光度，计算回收率(表1)。

表1 加样回收率试验结果

2.2.6 含量测定 精密称取同一批次供试品0.5 g，共6份，按供试品溶液制备法制备，在328 nm处测定吸光度，结果绿原酸的平均含量为660.6792 μg/g。

3 讨论

3.1 薄层鉴别 在研究女贞子的薄层鉴别时，根据参考文献资料［2－3］选择了几种方法进行比较。首先是供试液的制备，文献资料上都用的是加热回流，采用这种方法，用时较长，操作不方便，于是改为超声处理，过滤后取滤液，这样时间大大地缩短了，而且超声提取比较完全;在进行薄层展开时，采用过以正己烷－三氯甲烷－乙酸乙酯－冰乙酸(17∶10 ∶3 ∶0.3)为展开剂，结果喷以 5%香草醛乙酸－高氯酸(1∶4)溶液显色后，供试品与对照品的斑点不在同一位置，且放在365 nm紫外光灯观察时没有相应的斑点。后改用以环己烷－丙酮－乙酸乙酯(5∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰。置紫外光灯(365 nm)下检视，结果出现很清晰的薄层色谱图，重现性更好，阴性样品无干扰。

在研究枸杞子的薄层色谱鉴别时，参考文献资料［4－5］选择了几种方法进行比较。首先是供试液的制备，文献资料上都用的是加热回流，冷却，静置一段时间后取上清液。采用这种方法，用时较长，提取不完全，不利于生产实际应用，所以改为超声处理，过滤后取滤液，这样时间大大地缩短了，而且超声提取比较完全;其次是溶剂方面，文献资料上提取的溶剂有乙醚、三氯甲烷，而本试验选择水。乙醚和三氯甲烷都是有毒液体，特别是乙醚具有很强的挥发性，极易燃且具有麻醉性，所以在不影响检测结果的情况下，选择了更为安全的水作为溶剂。在展开剂的选择上，曾选用过甲苯－乙醚－冰乙酸(体积比10∶10∶0.1)和三氯甲烷－乙酸乙酯－苯－甲酸(5∶6∶3∶1)2种展开剂，但是相比于乙酸乙酯－三氯甲烷－甲酸(3∶2∶1)，后者的展开效果更好，图像更清晰，重现性更好，阴性样品无干扰。

在研究金银花的薄层色谱鉴别时，参考文献资料［6－7］选择了几种方法进行比较。供试液的制备方法中将水浴加热回流改为超声处理，这样用时短，操作便捷，有利于生产实际应用;其次是薄层板的选择。大量文献资料用的都是硅胶G板，但是在试验过程中发现，用硅胶G板进行复方黄芪金银花颗粒中金银花的鉴别时，出现阴性样品干扰，所以将硅胶G板改为硅胶H板，这样在同样的条件下，硅胶H板展开效果更好，图像更清晰，重现性更好，阴性样品无干扰。

在研究黄芪的薄层鉴别［8－9］时，曾使用三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水(10∶20∶11∶5)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，发现目标斑点Rf值偏低，换用三氯甲烷－甲醇－水(13∶6∶2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂后，发现斑点较为圆整，且Rf值比较合理。

3.2 含量测定方面 绿原酸为酚酸类成分，具有良好的水溶性。但由于分子结构中含有酯键、不饱和键及多元酚而不稳定，绿原酸水溶液易发生水解和氧化反应，虽然在制备供试溶液时使用的是50%甲醇溶液，但也应该将样品溶液贮存在避光低温的环境中，试验过程中应尽量避光操作，最好选择棕色的容器。

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