鸡新城疫活疫苗种毒HB1株和F株保存期试验

吴 涛，毛娅卿，王 嘉，王 哲，蒋桃珍

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

鸡新城疫(ND)是一种具有高度传染性的病毒性疾病，世界各地养禽业均采用疫苗进行免疫接种来控制鸡新城疫的发生［1］。鸡新城疫病毒HB1株(Ⅱ系)和F株(Ⅲ系)是制备鸡新城疫低毒力活疫苗的生产用毒种，《中华人民共和国兽用生物制品规程》［2］(二〇〇〇年版)中规定，鸡新城疫病毒HB1株和F株，在－15℃以下，保存期为6年。对疫苗生产用毒种的繁殖冻干与检定，不仅需要较长的时间，还消耗一定的人力、物力和财力，增加污染外源病毒的机会，因此需要对毒种制定更加合理的保存期。

1 材料和方法

1.1 材料 鸡新城疫病毒HB1株(Ⅱ系)，本实验室分别在1993年6月、1997年3月、2003年2月繁殖冻干，检定合格后交菌种保藏室－70℃保存。鸡新城疫病毒F株(Ⅲ系)，本实验室分别在1989年12月、1995年4月、2001年3月繁殖冻干，－70℃保存。鸡新城疫强毒(北京株)，中国兽医药品监察所2006年6月冻干、检定，－70℃保存。

SPF鸡:1月龄，SPF鸡胚:10日龄，均购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毒种病毒含量测定 每批冻干的毒种在试验时从－70℃冰柜中任取3支，按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二〇〇〇年版)中病毒含量测定方法，分别按瓶签注明的装量加灭菌生理盐水恢复后，继续做10倍系列稀释至 10－9，取10－7、10－8、10－9三个滴度，各经尿囊腔途径接种 10日龄SPF鸡胚5枚，每胚接种0.1 mL，至37℃条件孵育，每日照蛋。孵育120 h后，取出所有活胚，逐个收获胚液，分别测定血凝价;48～120 h死胚(48 h以前死胚，弃去不计)同一稀释度等量混合，分别测定血凝价，计算EID50。

1.2.2 毒种的免疫原性鉴定

1.2.2.1 接种 每批种毒任取1支，用灭菌生理盐水分别进行稀释，使其含毒量分别为2500 EID50/0.1 mL、5000 EID50/0.1 mL 和 10000 EID50/0.1 mL，每个滴度滴鼻接种1月龄SPF鸡10只，每只滴鼻0.1 mL;同时设空白对照5只，隔离饲养观察14 d。

1.2.2.2 攻毒 取ND强毒(北京株)1支，用灭菌生理盐水进行105倍稀释后，对所有鸡进行攻毒，每只鸡肌肉注射1 mL(含毒104ELD50/mL)，隔离饲养观察14 d。

2 结果

2.1 毒种的病毒含量测定 结果如表1、表2所示。

表1 不同保存年代的新城疫病毒HB1株病毒含量测定结果

表2 不同保存年代的新城疫病毒F株病毒含量测定结果

由表1和表2可以看出，鸡新城疫病毒HB1株和F株毒种在－70℃分别保存16年和19年，病毒含量仍符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二〇〇 〇 年 版)［2］规 定 (病 毒 含 量应 ≥108.0EID50/0.1 mL)。

2.2 毒种的免疫原性鉴定 结果如表3、表4所示。

表3 不同保存年代的新城疫病毒HB1株免疫原性试验结果

表4 不同保存年代的新城疫病毒F株免疫原性试验结果

由表3和表4可以看出，鸡新城疫病毒HB1株和F株毒种在－70℃分别保存16年和19年，免疫原性仍符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二〇〇〇年版)中最小免疫量应≤5000 EID50的规定。

3 讨论

3.1 对疫苗生产用毒种的繁殖冻干与检定，不仅需要较长的时间，消耗一定的人力、物力和财力，而且还会增加污染外源病毒的机会，因此需要对毒种的保存制定更加合理的保存期。按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二〇〇〇年版)的规定，鸡新城疫病毒HB1株和F株毒种在－15℃的保存期为6年。从本试验的结果看，新城疫病毒HB1株毒种在－70℃条件下保存6年、12年、16年;新城疫病毒F株毒种在－70℃条件下保存8年、14年、19年，病毒含量、免疫原性均无明显变化，均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二〇〇〇年版)规定。本试验结果表明，可延长新城疫病毒HB1株和F株毒种的保存期。

3.2 鸡新城疫病毒HB1株和F株毒种在繁殖冻干时已按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二〇〇〇年版)进行了相应的鉴定工作，此次保存期试验对不同保存年代毒株的病毒含量和免疫原性进行试验，结果均符合规定，表明该毒株在－70℃保存15年以上仍可作为制备鸡新城疫低毒力活疫苗毒种使用。

［1］殷 震，刘景华.动物病毒学［M］.第2版.北京:科学出版社，1997:748－749.

［2］农业部兽用生物制品规程委员会.中华人民共和国兽用生物制品规程(二〇〇〇年版)［M］.北京:化学工业出版社，2000:220－221.