国内5种猪圆环病毒PCV2抗体检测试剂盒的比较试验

吴华伟，高金源，邓 永，范 鹃，郎洪武，陈晓春

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081;2.扬州优邦生物制药有限公司，江苏扬州 225008)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)，属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属的成员，是目前发现的最小的动物病毒。自20世纪90年代发现该病毒以来，PCV2病毒在世界各国迅速蔓延。我国于2000年检测到了该病毒的存在［1］。PCV2抗体检测对于进行PCV2流行病学调查、疫苗效果评价及试验用阴性猪的筛选等具有重要意义。目前，PCV2抗体检测的常用方法有病毒中和试验(SN)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验法(IPMA)。鉴于SN方法费时耗力，且PCV2病毒在细胞上很难出现细胞病变，常需借助免疫荧光试验(FA或IFA)进行结果判定。因此常用ELISA或IPMA方法进行PCV2抗体检测。国内已有商品化的猪圆环病毒PCV2抗体检测试剂盒出售［2－3］。为了解目前国内PCV2灭活疫苗效力检验用PCV2抗体检测试剂盒的质量，本试验选取国内5个厂家生产的5种PCV2抗体检测试剂盒(其中4种为ELISA方法，1种为IP-MA方法)，分别对其进行敏感性、特异性和符合率测定，为实际应用提供了一定的依据。

1 材料

1.1 试剂盒 猪圆环病毒PCVII型抗体检测试剂盒(荷兰CEDI)，批号为170408;猪圆环病毒PCV2 ELISA抗体检测试剂盒(A企业)，批号为081103;猪圆环病毒PCV2 ELISA抗体检测试剂盒(B企业)，批号为100805;猪圆环病毒PCV2 ELISA抗体检测试剂盒(C企业)，批号为100807;猪圆环病毒PCV2 ELISA抗体检测试剂盒(D企业)，批号为20101101;猪圆环病毒PCV2抗体IPMA检测试剂盒(E企业)，批号为20100417。

1.2 检测试剂和血清 检测PCV2抗体用间接免疫荧光检测板(96孔/块)、PK15细胞空白对照板(96孔/块)均由本实验室制备;FITC标记的羊抗猪IgG为Sigma公司产品;PCV2阳性血清和阴性血清样本，由本实验室鉴定和保存。

1.3 主要仪器 恒温培养箱(SANYO);微量移液器(effendorf);酶标仪(Thermo/1500型);荧光显微镜(OLYMPUS/IX71型)。

2 方法

2.1 标准阳性血清和阴性血清的确定 对本试验室保存的PCV2血清样品，先采用荷兰CEDI公司生产的猪圆环病毒PCVII型抗体检测试剂盒进行初筛，然后按文献［4］的方法进行间接免疫荧光试验，以两种方法检测结果均一致的血清样品作为标准血清样品。

2.2 试剂盒敏感性、特异性和符合率测定 按各厂家提供的试剂盒使用说明书的操作方法，分别对标准阳性血清和标准阴性血清进行检测，参照农业部第683号公告有关规定，评价国内各试剂盒的敏感性、特异性和符合率。其计算公式如下:敏感性=(与标准阳性血清检测结果一致的血清份数/标准阳性血清总份数)×100%;特异性=(与标准阴性血清检测结果一致的血清份数/标准阴性血清总份数)×100%;符合率=(与标准血清检测结果一致的血清份数/标准血清总份数)×100%。

3 结果与分析

3.1 5个企业的PCV2试剂盒的敏感性、特异性和符合率测定结果 按以上方法共筛选出57份标准血清样品，其中标准阳性血清26份，标准阴性血清31份。分别用5个企业生产的PCV2抗体检测试剂盒检测57份标准血清，结果如表1所示。从敏感性测定结果看，企业A和企业E生产的PCV2抗体检测试剂盒敏感性均达到100%(26/26)，而其他3个企业的PCV2抗体检测试剂盒敏感性仅在57.7% ～76.9%;从特异性测定结果看，5个企业的试剂盒特异性基本保持在90%左右(87.1% ～93.5%);从符合率看，除企业C和企业D的PCV2抗体检测试剂盒符合率较低，为75.4%，其余3个企业的PCV2抗体检测试剂盒符合率在86%以上。表明国内生产的PCV2抗体检测试剂盒特异性相对较好，但不同厂家敏感性差异较大。

表1 5个企业生产的PCV2抗体检测试剂盒检测57份标准血清结果

3.2 5个企业试剂盒间检测结果的符合率测定从表2可以看出，5个企业试剂盒检测与标准阳性血清和标准阴性血清检测结果完全一致的血清份数为36份(其中标准阳性血清19份，标准阴性血清17份)，总体符合率为63.2%(36/57)。说明国内各企业生产的PCV2抗体检测试剂盒之间检测结果的符合性较差，需要进一步改进。

表2 5个企业试剂盒间检测结果的一致性

4 讨论

尽管攻毒试验是评价PCV2灭活疫苗效力的最可靠方法，但因其操作繁琐，且需要严格的生物安全措施，因此常采用PCV2抗体检测作为PCV2灭活疫苗效力评价的替代方法。国内企业已申报的PCV2灭活疫苗，如PCV2灭活疫苗(SH株)和PCV2灭活疫苗(DBN－SX07株)均采用ELISA方法进行免疫动物抗体水平检测，而PCV2灭活疫苗(LG株)则采用IPMA方法进行免疫动物抗体水平检测。然而，实际应用中，大多数疫苗生产企业在进行疫苗效力评价时所用的试剂盒均为自行制备的或购买的未获国家批准的产品，缺少必要的质量验证和监管措施，存在一定的质量隐患。从本试验选取的5个企业生产的PCV2抗体检测试剂盒(其中企业A已获农业部批准，其余4种均未获准正式生产)的检测结果看，企业A的ELISA试剂盒和企业E生产的PCV2－IPMA法检测试剂盒敏感性和特异性相对较好，可以作为PCV2抗体监测和疫苗效力评价的首选，其余3个企业的PCV2抗体检测试剂盒敏感性较差，不太适合作为评价PCV2灭活疫苗免疫动物后产生抗体的检测手段，且各试剂盒间检测结果的一致性较差。因此，在新兽用生物制品申报时，对采用未经正式批准的试剂或试剂盒进行制品质量的评价(特别是在有可能影响制品质量的关键环节，如试验猪筛选、效力检验等)是否可行，以及如何加强对这些试剂或试剂盒的验证或管理，亟待有关部门深入研究，尽快出台有关规定。总体上看，国内的PCV2抗体检测试剂盒种类繁多，质量参差不齐。科研单位需进一步加大科研力度，兽医行政部门需进一步加强试剂盒技术规范，完善质量验证的相关程序和制度，同时加强试剂盒监督检验力度，确保PCV2试剂盒敏感、特异、质量可控，更好地服务于PCV2疫病监测和防控工作。

［1］郎洪武，张广川，吴发权，等.断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测［J］.中国兽医科技，2000，30(3):325.

［2］农业部.中华人民共和国农业部公告第742号［Z］.

［3］农业部.中华人民共和国农业部公告第1220号［Z］.

［4］Allan G M，Ellis J A.Porcine Circoviruses:a Review［J］.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2000，12(1):3 －14.