4种黑曲霉基因组DNA提取方法的比较

张晓利 吕雪莲 沈永年 吕桂霞 王淼淼 葛一平 刘维达

(1.暨南大学临床医学博士后流动站，广州510632;2.大连皮肤病医院，大连116011;3.中国医学科学院皮肤病研究所，南京210042;4.苏州大学第一附属医院，苏州215006)

真菌DNA的提取是包括分子诊断在内的所有真菌分子生物学实验的基础［1］，简便快捷地提取真菌DNA，且获得的DNA完整、纯度高，对真菌分子生物学的后续实验操作有极其重要的意义。丝状真菌的细胞壁结构坚固，且富含多糖，破壁比较困难，而DNA的提取效率，尤其是DNA的纯度可严重影响实验结果［2］。同一标本采用不同方法或不同标本采用相同方法提取DNA 其纯度和提取率有有很大差异。本实验以产黑色素最为丰富的黑曲霉为例，通过检测DNA浓度、PCR扩增等方法比较了几种DNA提取方法的优劣。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及菌株

引物合成购自上海生生物工程技术设备有限公司，热启动Taq酶、dNTP和核酸内切酶 Hha I、Hinf I、Hae III、Taq I、Msp I购自大连宝生物工程有限公司。实验所用标准菌黑曲霉［CMCCC(F).A3］由中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心提供。

1.2 菌株的培养和收集

将黑曲霉接种到PDA培养基上培养7～14 d至成熟，收集上层孢子至生理盐水中，振荡，制成孢子悬液，取菌悬液接种至PDA培养基上，28℃培养。两个时间段收集菌种:一为3 d菌龄 (菌丝为白色，且该菌株未产生大量黑色的分生孢子);另一为10 d左右菌龄(该菌株产生大量黑色的分生孢子)。后续实验按照石英砂+CTAB法提取基因组DNA。

1.3 DNA 提取方法

包括氯化苄法、石英砂+CTAB法、微波法和Biospin试剂盒法4种方法的比较。

氯化苄法 将菌丝体加入5 mL研磨器中，加500μL的氯化苄提取液，研磨。将研磨液加入1.5 mL无菌EP管中，再加入125μL 10%SDS和300 μL氯化苄原液。50℃水浴60 min，然后加入NaAc 300μL，冰浴，离心取上清液，加入等体积的异丙醇，室温沉淀30 min，溶于100μL TE缓冲液。

石英砂+CTAB法 加石英砂及400μL 10×TE Buffer到无菌的EP管中，刮入菌丝体。加入120 μL 10%SDS，加入10 μL蛋白酶 K，混匀，65℃水浴30 min，加入120μL 5 mol/L NaCl，加入约65 μL的10%CTAB，65℃水浴60 min。加入等体积的氯仿:异戊醇 (24∶1)，轻柔混匀。离心取上清液至无菌EP管中。加225μL NH4Ac，取上清液至无菌 EP管中，加入 510μL异丙醇，-20℃放置 30 min，离心弃上清液，用70%乙醇清洗沉淀物，用50 μL TE Buffer溶解沉淀。

微波法 将菌丝体加入5 mL研磨器中，加300μL缓冲液，研磨。将研磨液加入1.5 mL无菌EP管中，加少量石英砂，加100μL裂解液。将EP管置于微波炉中，600 W，共100 s。加入400μL抽提液，倒置振荡5 s，加入600μL Tris饱和酚氯仿抽提，混匀5 s。离心取上清液加等体积异丙醇，离心，70%乙醇洗两次室温下晾干，用50 μL TE Buffer溶解。

Biospin试剂盒 将菌丝体用5 mL研磨器研磨过后，放入2 mL微量离心管中。加400μL TE Buffer，于65℃环境中温浴30 min。加入130μL DA Buffer，于冰浴中放置5 min。离心将上清液转移离心管，加750μL的E Binding Buffer，将混合液体转移至Spin column，加入500μL的 G Binding Buffer离心，再加入Wash Buffer。最后Spin column中加入150 μL Elution Buffer，离心并弃去 Spin column。

1.4 基因组DNA样品直接电泳检测

取几种方法提取的基因组DNA 4μL，与适量6×Loading Buffer混合，采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1×TAE，恒压80 V，电泳约30 min。电泳结束后，取琼脂糖凝胶在凝胶成像仪上紫外线透射下观察结果并摄片。

1.5 基因组DNA-ITS的PCR扩增

真菌通用引物 ITS1(5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇)和 ITS4(5＇-TCCTCCGCTTATTGATAT-3＇)，反应总体积为25 μL，含 4 μL 10 × 缓冲液，1.5 μL MgCl2(10 mmol/L)，2 μL dNTPmix(10 μmol/L)，引物 (10 μmol/L)各 0.5 μL，DNA 模板2μL，Taq DNA聚合酶2U。反应条件为95℃ 5 min预变性后 95℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，共进行30个循环，最后72℃延伸10 min。扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，每个加样孔点样4 μL，电泳缓冲液为1×TAE，恒压80 V，电泳约30 min。电泳结束后，取琼脂糖凝胶在凝胶成像仪上紫外线透射下观察结果并摄片。

1.6 基因组DNA浓度和产率测定

使用Invitrogen Quant-iTTM试剂盒测定样本的浓度，严格按照说明书操作;用所测的DNA浓度和测量的菌丝体的重量(湿重)之比计算产率。

2 结 果

2.1 菌株培养时间的确定

黑曲霉培养3 d内，菌落为白色时，未长出黑色孢子，收集的菌落主要为菌丝，用体视显微镜观察结构 (见图1);黑曲霉培养10 d左右，菌落产生大量的孢子和色素，收集的菌落大部分为孢子，并见部分菌丝(见图2)。培养3 d内DNA溶液为透明无色，培养10 d DNA溶液为淡褐色 (见图3)。用相应的DNA做为模板进行PCR扩增，结果见图4。培养3 d内DNA模板成功扩增出约600 bp的片段，培养10 d的DNA模板PCR反应为阴性。

2.2 4种方法提取的黑曲霉基因组DNA直接电泳结果

4种方法提取的DNA直接电泳都有阳性条带，以石英砂+CTAB法的条带最亮，且没有拖尾;微波法的亮度高，但有明显拖尾;Biospin试剂盒法的条带最弱(见图5)。

2.3 4种方法提取的黑曲霉基因组DNA-ITS的PCR扩增结果

4种方法均能扩增出阳性条带，以石英砂+CTAB法条带最亮 (见图6)。

2.4 基因组DNA浓度和产率测定结果

4种方法中以石英砂+CTAB法提取后的黑曲霉基因组DNA的浓度和产率最高，与基因组DNA直接电泳结果一致(见表1)。

图1 培养3 d左右菌落形态 图2 培养10 d左右菌落形态 图3 基因组DNA溶液 图4 模板DNA-ITSPCR扩增电泳图 图5 基因组DNA直接电泳图:M.100 bp Ladder，1～4.分别为氯化苄法、石英砂+CTAB法、微波法、Biospin试剂盒法 图6 基因组DNA-ITS的PCR扩增结果:M.100 bp Ladder，1～4.分别为氯化苄法、石英砂+CTAB法、微波法、Biospin试剂盒法Fig.1 Colonies after 3 ds Fig.2 Colonies after 10 ds Fig.3 Template DNA solution Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR products:M.100 bp Ladder Fig.5 Agarose gel electrophoresis of template DNA:M.100 bp Ladder;1-4.Benzyl Chloride method，quartz sand+CTAB，microwave method，Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit Fig.6 Agarose gel electrophoresis of PCR products:M.100 bp Ladder;1-4.Benzyl Chloride method，quartz sand+CTAB，microwave method，Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit

表1 4种方法提取的基因组DNA浓度和产率结果Tab.1 Concentration and yield results of template DNA by 4 methods

3 讨 论

近些年以PCR技术为基础的分子生物学方法不断发展并越来越多地被应用至临床［3］。为保证真菌PCR技术及其相关分子生物学技术的顺利开展，简单快捷地获取DNA，且获得完整、高纯度的DNA，是所有病原真菌分子实验必须解决的前提。DNA的提取效率，尤其是DNA的纯度可明显影响后续的实验结果。同一标本采用不同方法或不同标本采用相同方法提取的DNA其纯度和提取率有很大差异。

丝状真菌细胞壁坚韧厚实的构成需要较为繁琐的破壁手段，这样就使真菌DNA的提取较细菌或其他组织细胞的难度更大［4］。真菌DNA提取方法颇多，主要区别在于破壁方法以及破壁后分离核酸、蛋白质方法的不同。常用的破壁方法有机械法、酶法和化学法等，其中液氮研磨是最常用的机械破壁方法。但液氮研磨需要的菌体较多，研磨的容器为体积较大的研钵，在研磨过程中菌体丢失较多，同时因暴露在空气中也容易污染;在研磨过程中如果研磨时间和力度掌握不好，极易造成基因组DNA的断裂和不完整［5］。很多学者在实验研究中发现，液氮研磨过的菌体所提取的DNA直接电泳拖尾现象严重，所以在本实验中，我们没有选择液氮研磨法作为比对。

本实验中，所用的方法能提取到DNA并能成功进行PCR扩增，最关键的就是确定了实验用菌的培养时间。因为丝状真菌的细胞壁主要成分为几丁质，与细菌或者是酵母菌相比其结构要坚固。但真菌细胞壁各成分的比例在细胞生活周期的过程中是存在差异的，一般而言，当真菌细胞处于幼嫩时期时，破壁相对容易些［6］。在本实验开始时，我们参考各文献［7］，用生长10 d左右的成熟菌株进行实验，但所得DNA溶液均有不同程度的黑色素溶解其中。虽然后来也制订了相应的纯化方法，使之能够成功进行PCR扩增，但纯化过程包括离心，清洗等步骤，耗时在1～2 h之间;有时候一次纯化不成功，尚需要第二次、第三次纯化，DNA的含量会随之逐次明显减少。所以我们选择了生长伊始的菌落，大部分为菌丝，只有少量孢子，不仅破壁较容易，DNA获取率高，最终提取的DNA较纯，没有抑制PCR反应的色素存在，可以不用纯化直接用于PCR扩增。更重要的，我们认为，在菌落早期提取DNA不仅可以提前数天 (5 d以上)进行菌种鉴定，也意味着可以提前对接种了一定量标本的培养基上刚长出的菌落进行基因型鉴定，即可以大大缩短鉴定丝状真菌所需的时间，这对临床遇到的由丝状真菌引起的危重感染的救治十分重要和关键。

4种提取方法均能获得一定量的DNA，长度一致，但提取率和纯度因方法的不同有较大差异。石英砂+CTAB法所得的基因组DNA浓度最大，明显要高于其他三种方法，后续的PCR反应得到的条带也最亮;微波法虽然得到的基因组DNA浓度较好，但纯度较差，有明显的拖尾;Biospin试剂盒提取基因组DNA量较少，但纯度高，并且整个实验所耗时间较短，不需要另外配制试剂和高温高压灭菌，在实验较急且没有相应试剂的情况下可以试用。

［1］ Chen SC，Halliday CL，Meyer W.A review of nucleic acidbased diagnostic tests for systemic mycoses with an emphasis on polymerase chain reaction-based assays［J］.Med Mycol，2002，40(4):333-357.

［2］ Maaroufi Y，Ahariz N，Husson M，et al.Comparison of different methods of isolation of DNA of commonly encountered Candida species and its quantitation by using a real-time PCR-based assay［J］.J Clin Microbiol，2004，42(7):3159-3163.

［3］ 张晓利，吕雪莲，沈永年，等.PCR-RFLP和多重PCR技术检测常见病原性丝状真菌的实验研究［J］.中国真菌学杂志，2010，4(5):105-108.

［4］ Haugland RA，Brinkman N，Vesper SJ.Evaluation of rapid DNA extraction methods for the quantitative detection of fungi using realtime PCR analysis［J］.JMicrobiol Methods，2002，50(3):319-323.

［5］ Haugland RA，Heckman JL，Wymer LJ.Evaluation of different methods for the extraction of DNA from fungal conidia by quantitative competitive PCR analysis［J］.JMicrobiol Methods，1999，37(2):165-176.

［6］ Griffin DW，Kellogg CA，Peak KK，et al.A rapid and efficient assay for extracting DNA from fungi［J］.Lett Appl Microbiol，2002，34(3):210-214.

［7］ Clarkson AI，Lefevre P，Titchener-Hooker NJ.A study of process interactions between cell disruption and debris clarification stages in the recovery of yeast intracellular products［J］.Biotechnol Prog，1993，9(5):462-467.