血浆 (1，3)-β-D-葡聚糖对深部真菌感染诊断的临床意义

杨惠琴 梅亚宁

(1.江苏省东台市人民医院检验科，东台224200;2.南京医科大学第一附属医院检验科，南京210029)

近年来随着广谱抗菌药物，高强度免疫抑制剂和抗肿瘤药物的广泛应用，以及造血干细胞、实体器官移植的广泛开展，各种导管的体内介入、留置等，临床上侵袭性真菌感染 (invasive fungal infections，IFI)的患病率明显上升。在医院感染中占重要地位，引起临床极大重视，深部真菌病的疗效与转归，很大程度上取决于能否早期诊断。传统的微生物分离培养与鉴定需要时间较长。研究表明，除接合菌外，所有真菌细胞膜上都含有 (1，3)-β-D-葡聚糖，而其他微生物、动物及人的细胞成分和细胞外液都不含这种成分，因此在机体的体液中检测到(1，3)-β-D-葡聚糖是诊断深部真菌感染的有效依据［1］。我们应用MB-80微生物动态快速检测系统，对临床疑似深部真菌感染患者血浆中 (1，3)-β-D-葡聚糖的检测，并与传统真菌培养方法加以对比，探讨血浆 (1，3)-β-D-葡聚糖检测对深部真菌感染患者的临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选择2009年8月～2010年7月，我院住院疑似深部真菌感染的患者共1 868例 (其中男1 177例，女691例，年龄在17～90岁。

1.2 方法

在1 868例患者抽取静脉血做 (1，3)-β-D-葡聚糖检测和真菌培养的同时留取痰、中段尿、脓等分泌物标本做真菌培养，特殊患者留取腹水和脑脊液进行真菌培养。采用回顾性调查方法查阅患者住院病历，了解临床诊断 (患者的影像学，使用抗真菌药物症状是否缓解等)，并以临床诊断为标准对其进行统计学分析。

1.3 真菌分离培养及鉴定

标本的留取和真菌分离培养均按“全国临床检验操作规程”第三版进行操作。真菌鉴定，酵母菌采用CHRO Magar Candida显色培养基30℃培养48 h，根据菌落颜色鉴定白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌。不能用显色培养基鉴定的菌株，用沙氏培养基35℃培养48 h，分离纯化，用API 20C AUX鉴定到种，仍不能鉴定到种的为其他念珠菌;丝状真菌接种于察氏琼脂根据菌落形态、色素及镜下结构作出菌种鉴定。

1.4 (1，3)-β-D-葡聚糖检测

应用北京金山川科技有限公司MB-微生物动态快速检测系统及KT-5M Set动态真菌检测试剂盒定量检测血浆中 (1，3)-β-D-葡聚糖含量。

1.5 数据分析

分别计算G试验临界值为20 pg/mL和50 pg/mL时的敏感度 (诊断试验阳性患者/患者总数×100%)、特异度 (诊断试验阴性的非患者/患者总数×100%)、阳性预测值 (真阳性结果数/阳性试验结果总数×100%)和阴性预测值 (真阴性结果数/阴性试验结果总数×100%);真菌培养的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值;以及两试验联合应用后敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。

2 结 果

2.1 临床诊断情况

通过回顾性调查，1 868例患者中经临床用药、临床体征变化及组织学影像学等诊断标准临床诊断为深部真菌感染757例，非感染1 082例。无临床资料的29例 (剔除);实际有效病例1 839例。其中 (1，3)-β-D-葡聚糖含量检测阳性778例，阴性1 061例，真菌培养阳性457例，阴性1 382例。

2.2 G试验检测结果

经临床诊断真菌感染的757例患者中 (1，3)-β-D-葡聚糖含量最高为2 056 pg/mL，最低为11.626 pg/mL，均值为 (563.17 ±172.53)pg/mL;非感染1 082例中 (1，3)-β-D-葡聚糖含量最高为156 pg/mL，最低为5.0 pg/mL，均值为 (3.37 ±1.03)pg/mL;两组 (1，3)-β-D-葡聚糖含量差异显著(P ＜0.01)。

2.3 G试验敏感度、特异度

以20 pg/mL为临界值时，G试验阳性778例，敏感度和特异度分别为89.3%和90.6%;阳性预测值和阴性预测值分别为86.9%和92.4%;以50 pg/mL为临界值时，G试验阳性623例，敏感度和特异度分别为74.9%和94.8%;阳性预测值和阴性预测值分别为91.0%和84.4%，G试验与临床诊断的比较见表1。

表1 G试验与临床诊断比较Tab.1 Clinical data between groups

2.4 真菌培养结果菌种分布情况

标本来源以呼吸道标本为主，泌尿道、肠道次之。有的患者多部位分离出同一种真菌，作1例统计 (归到无菌体液部位感染)，详见表2。

表2 真菌培养结果菌种分布情况(株)Tab.2 Fungi distribution

2.5 真菌培养敏感度、特异度

真菌培养的敏感度和特异度分别为49.0%和92.1%;阳性预测值和阴性预测值分别为81.2%和 72.1%。

2.6 联合检测敏感度、特异度

G试验(临界值20 pg/mL)或真菌培养二者同时阳性或者其中任一项检测为阳性时即判断为阳性时，对于侵袭性真菌感染诊断的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为93.0%，88.9%，45.3%和93.7%。两种方法对深部真菌感染的检验结果见表3。

表3 两种方法对深部真菌感染的检验结果Tab.3 Deep fungal infection by two different methods

3 讨 论

近年来随着广谱抗菌药物、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛应用深部真菌感染(invasive fungal infection，IFI)的发病率呈逐年上升势态，介入性操作诊疗技术的发展及应用，器官移植的普及，使很多危重患者延长了生存时间，但也是并发IFI的主要原因之一，尽管采取了有力的抗真菌治疗，深部真菌感染的死亡率仍然很高，其重要原因之一就是深部真菌感染的早期诊断困难，延误了临床抗真菌的治疗，使患者病情恶化，死亡率增加。尽早诊断对深部真菌感染的治疗和预后有重要作用［2］。

(1，3)-β-D-葡聚糖抗原［(1，3)-β-D-glucan，BG］的检测，是一种新的真菌抗原检测方法，在深部真菌感染早期诊断上有着重要意义，近年来备受关注。(1，3)-β-D-葡聚糖是除接合菌属外真菌细胞壁上的一种特征性的多糖成分，其他微生物如细菌、病毒及动物的细胞外液则缺乏此种多糖，具有真菌特异性。(1，3)-β-D-葡聚糖在真菌生长时释放入血，对数生长期释放量最大，在真菌生长1 d后开始下降。其在正常人血浆中的浓度很低 (常低于10 pg/mL)，而深部真菌感染者却可明显增高(常高于 20 pg/mL)［3，4］。但对定植的念珠菌显示阴性［5］。故检测患者血中 (1，3)-β-D-葡聚糖可预测深部真菌感染。

市场上现在常用的试剂盒主要有两种，一种是日本Seikagaku Kogyo公司研制的Fungitec.G glu-can试剂，一种是美国Cape Code协会研制的Glucatell试剂。两种试剂的主要区别在于使用不同品种的马蹄鲎为原材料，Fungitec.G试剂主要成分是东方鲎的细胞裂解产物，其判断标准为20 pg/mL，而Glucatell试剂则使用美洲鲎的细胞裂解产物作为主要原料，推荐使用的判断标准为60 pg/mL［6］。目前(1，3)-β-D-葡聚糖的检测国内报道较多的是采取G试验的方法，国产试剂有北京金山川科技发展有限公司生产的GKT-5M Set动态真菌检测试剂盒(定量)，利用MB-80微生物快速动态检测系统对(1，3)-β-D-葡聚糖抗原进行检测。此方法特异性和敏感性可因设定的阳性临界值不同而不同，对阳性界值的设定也一直在讨论中，国内文献报道较多的BG阳性界值设定分别在50 pg/mL或20 pg/mL。本实验以50 pg/mL为阳性界值时，BG检测的敏感性为74.9%，特异性94.8%，阳性预测值和阴性预测值分别为91.0%和84.4%;以20 pg/mL为临界值，BG检测的敏感性和特异性分别为89.3%和90.6%，阳性预测值和阴性预测值分别为 86.9%和 92.4%;与文献报道一致［7，8］。本研究显示无论以50 pg/mL为阳性界值还是以20 pg/mL为阳性界值时均有较好的敏感性和特异性，在3例脑脊液培养为隐球菌的病例中有一例BG值为40.3 pg/mL，2 例 ＜20 pg/mL，同时对其他临床病例跟踪观察以50 pg/mL为临界值时与深部真菌感染有较好的一致性且本试验的假阳性较高，若降低临界值会增加试验的假阳性，我们建议临床采用以50 pg/mL为临界值。

病原学检查(特别是真菌培养)，目前在临床上，对于深部真菌感染仍然是一种常规诊断标准，它能明确引起感染的真菌种类，并可根据相应真菌进行体外药敏试验，为临床合理使用抗真药菌物提供有效依据。但此方法费时，通常需3～5 d;阳性率也不高，且易将正常带菌者误诊为深部真菌感染，不适宜作早期诊断。本试验中真菌培养阳性率为24.81%，培养阳性标本主要来源呼吸道、泌尿道和肠道，约占91.25%，这些部位是菌群失调的好发部位，同时导管的体内介入、留置、广谱抗菌药物及免疫抑制剂的大量使用，给真菌定植创造了条件。本试验中靠病原学 (真菌培养)诊断为深部真菌感染的患者共457例，其中86例缺乏临床拟诊的有效佐证;34例真菌培养阳性，(1，3)-β-D-葡聚糖检测 ＜ 20 pg/mL 病例中，17例一次痰培养为念珠菌，8例一次粪培养为念珠菌，3例 (均为插导尿管的老年患者)中段尿二次培养为同一种念珠菌，2例脑脊液培养为隐球菌，4例痰培养二次为烟曲霉。

本试验发现，无论阳性临界值为20 pg/mL还是50 pg/mL，均有多例(193、246)与临床诊断不符的病例，即假阳性和假阴性的问题，这是该检测方法的不足之处，国内外普遍存在。跟踪调查发现多数病例的患者检测前服用过香菇多糖或使用过免疫球蛋白等血液制品、抗肿瘤药物等，也有数例肾透析及免疫性疾病 (1例红斑狼疮、1例硬皮病)，这可能是，造成假阳性结果的原因［9-11］。但在跟踪调查中我们发现有4例细菌血症(1例大肠埃希菌，1例金黄色葡萄球菌，2例铜绿假单胞菌)BG值也＞150 pg/mL。可能是由于BG的测定原理与内毒素十分相似，易受血中细菌的干扰而造成假阳性。其余为数不多的不符病例，未找出明显原因，尚须进一步研究和观察。

总之，G试验作为一种深部真菌感染的初步筛查方法是非常有意义的;使用时再紧密结合患者的临床表现、病原学检查等，加强动态监测，就一定能发挥其快速、准确的作用，给临床提供早期治疗的依据，降低病死率，改善预后。

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