应用CLSI M38-A2方案测定须癣毛癣菌对抗真菌药物敏感性

胡小平 万喆 李若瑜

(北京大学第一医院皮肤性病科真菌室、北京大学真菌和真菌病研究中心，北京100034)

须癣毛癣菌 (Trichophyton mentagrophytes，T.m)是头癣、体癣、股癣、手足癣和甲癣的病原菌之一，是世界范围内第二大常见的皮肤癣菌。近年来分子系统学研究证实须癣毛癣菌为一复合体，包含几个不同种的真菌。我们对44株经形态学鉴定的须癣毛癣菌复合体进行培养和分子生物学鉴定，发现38株属于趾间型毛癣菌(T.interdigitale)占＞95%，6株属于苯海姆节皮菌 (A.benhamiae)。面对众多的抗真菌药物，需要合适的方法来选择药物以指导临床治疗。目前国内对丝状真菌的药敏试验主要参考美国临床和实验室标准化研究所(clinical and laboratory standards institute，CLSI)于2003年颁布的产孢丝状真菌抗真菌药敏试验方案M38-A。但此方案并未对皮肤癣菌药敏试验提出标准化操作。CLSI于2008年提出了M38-A2方案，此方案对皮肤癣菌的药敏实验条件和判读标准作了统一规定，成为皮肤癣菌药敏的标准试验方案。因此，本实验拟在国内首次应用M38-A2方案测定须癣毛癣菌的MIC，比较分离菌株的MIC值，为临床用药提供指导;并验证M38-A2方案用于须癣毛癣菌药敏实验的重复性和可行性。

1 材料和方法

1.1 实验菌株

菌株来源于全国南北方8个不同省市地区的临床分离株和分离自狐狸毛的菌株共44株。44株菌接种在沙堡氏培养基平皿中，28℃温箱培养14 d后，菌落正面为白色绒毛状或粉末状，反面棕黄色;小培养可见大小分生孢子;尿素酶试验和毛发穿孔试验均阳性;溴甲酚紫乳固体培养基上均呈II类反应，由此初步鉴定为须癣毛癣菌。对所有菌株进行PCR扩增核糖体DNA的内转录间隔区(ITS)和核糖体大亚基(LSU)D1-D2区，扩增产物纯化测序后利用数据库进行序列比对，对须癣毛癣菌进行分子鉴定。最终将44株菌鉴定为趾间型毛癣菌38株，无性型苯海姆节皮菌6株。

1.2 质控菌株

BMUO0273来自美国模式菌种保藏中心ATCC22019，须癣毛癣菌质控株来自美国模式菌种保藏中心ATCC MYA4439。

1.3 培养基

本研究采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，沙氏葡萄糖琼脂培养基 (SDA)，RPMI-1640液体培养基。

1.4 主要仪器和试剂

比浊仪为生物梅里埃公司 (Biomerieux Densimat)产品;96孔细胞培养板为青岛阿尔发医疗器械有限公司产品。RPMI-1640粉 (Gibco，USA);M0PS缓冲液(三氮吗啉丙磺酸，沃德赛斯生物公司);NaOH，DMSO(二甲基亚砜)。

1.5 抗真菌药物

氟康唑(FLU)和灰黄霉素 (GRI)为Sigma公司;伊曲康唑(ITR)、伏立康唑 (VIR)和阿莫罗芬(AMO)均为Galderma公司;特比萘芬 (TER)为山东齐鲁制药;环吡酮胺(CIC)为Aventis Pharma;联苯苄唑(BIF)为重庆青阳药业。8种药物纯度为98%～100%。依据M38-A2方案配制上述药物的储存液，其中水溶性药物氟康唑溶于无菌蒸馏水，其他脂溶性药物溶于二甲基亚砜 (DMSO)。每一批储存液均设溶剂对照。各药物工作液浓度范围为:氟康唑0.125～64μg/mL;伊曲康唑、环吡酮胺、联苯苄唑、灰黄霉素0.031 3～16μg/mL;伏立康唑0.007 81～4 μg/mL;特比萘芬0.000 937～0.5 μg/mL;阿莫罗芬0.001 87～1 μg/mL。

药敏板的配制 用16×100 mm无菌试管制备药物稀释液，用96孔(12×8)板进行实验，取0.1 mL依次加入96孔板的1～10列中，第11列为生长对照，只含有0.1 mL RPMI-1640，不含抗真菌药物，取0.2 mL RPMI-1640加入第12列作阴性对照，配制过程中每一浓度梯度完成后应更换枪头。配制好的药敏板储存在-20℃以备用。

1.6 抗真菌药物敏感性试验

改良真菌菌悬液制备 所有受试菌接种在PDA培养基，28℃培养10～14 d使其活化，取1 mL的生理盐水加入试管，用巴氏吸管轻轻抽吸后，将有孢子和菌丝片断的菌悬液吸到尖端开口并带滤纸的EP管后渗漏至另一无菌EP管，移液管转入比浊管后用比浊仪调整菌悬液浓度至 (2～3)×105CFU/mL，相当于比浊仪为0.2～0.3麦氏单位处，并用血细胞计数板计数验证达 (2～3)×105CFU/mL。取部分菌悬液用生理盐水稀释100倍，吸取0.01 mL调好的接种液接种至沙堡氏葡萄糖琼脂平皿上，将平皿于28℃ ～30℃下孵育并每日观察有无菌落形成。

原CLSI M38-A2方案和改良后真菌菌悬液制备方法的比较 选择ATCC MYA4439标准菌株采用原CLSI M38-A2方案菌悬液制备，将受试菌接种在PDA培养基，28℃培养10～14 d使其活化，取1 mL的无菌0.85%盐水覆盖菌落，轻轻用移液器尖端摩擦菌落制成菌悬液。使菌悬液沉淀5～10 min，用血细胞计数器计数孢子，并调整到 (2～3)×105CFU/mL。同时对标准菌株进行改良真菌菌悬液制备 (如上所述)。

液体培养基的接种 将菌悬液用RPMI-1640液体培养基稀释50倍，得到相当于2倍所需试验浓度(1×103～3×103CFU/mL)接种菌悬液。同时将配置好的药敏板取出室温下融化，用多头移液器固定吸头后，在96孔培养板除第12孔阴性对照不加，其余各孔均加入100μL菌悬液，35℃静止孵育培养，于96 h后观察结果。每次试验均应包括质控参考菌株。

结果判定 根据M38-A2的判读标准肉眼判读，伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、特比萘芬、灰黄霉素和环吡酮胺等与生长对照相比，出现80%以上生长抑制时作为判断最低抑菌浓度(MIC)值的终点标准。联苯苄唑和阿莫罗芬由于M38-A2方案未规定，我们暂规定采用肉眼观察80%受抑作为终点判断。每株受试菌株均重复做2次实验。为保证结果判读的标准性，本实验均由至少2人共同判读。

1.7 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件包对不同的抗真菌药物之间的MIC值进行Kruskal-Wallis秩和检验;不同菌种两两比较的秩和检验采用Mann-whitney U法。

2 结果

2.1 接种量

使用比浊仪制备菌悬液的接种量和进行平皿菌落计数的结果基本一致。44株菌均在 (1～3)×105CFU/mL之间，均值为1.8×105CFU/mL。

2.2 标准菌株采用原CLSI M38-A2方案和改良后真菌菌悬液制备方法的MIC值比较

原方案 伊曲康唑、伏立康唑、环吡酮胺、灰黄霉素、特比萘芬 MIC 值分别为:0.03μg/mL、0.03 μg/mL、0.5 μg/mL、0.15 μg/mL、0.002 μg/mL。

改良方案 伊曲康唑、伏立康唑、环吡酮胺、灰黄霉素、特比萘芬 MIC值分别为:0.06μg/mL、0.03 μg/mL、1 μg/mL、0.15 μg/mL、0.002 μg/mL。两种方案的MIC值基本接近。

2.3 8种抗真菌药物的MIC值范围和几何均数

伊曲康唑、伏立康唑、特比萘芬、阿莫罗芬MIC值较低，氟康唑、联苯苄唑MIC值较高。8种抗真菌药物的药敏试验MIC值范围依次为氟康唑0.25～64 μg/mL，MIC90为64 μg/mL;伊曲康唑0.031 2～2 μg/mL，MIC90为 0.5 μg/mL、环吡酮胺 1 ～2 μg/mL，MIC90为 2 μg/mL、联苯苄唑 0.031 2 ～ 4 μg/mL，MIC90为0.5 μg/mL、灰黄霉素 0.062 5 ～1 μg/mL，MIC90为0.5 μg/mL;伏立康唑0.015 6 ～0.5 μg/mL，MIC90为 0.125 μg/mL;特比萘芬 0.000 937 ～0.007 81 μg/mL，MIC90为0.003 8 μg/mL;阿莫罗芬 0.007 81 ～0.062 5 μg/mL，MIC90为 0.25 μg/mL(见表1)。

表1 不同抗真菌药物对须癣毛癣菌药敏试验的MIC值(μg/mL)Tab.1 MICs(μg/mL)of different antifungal agents against Trichophyton mentagrophytes in vitro

不同抗真菌药物对两种皮肤癣菌的药敏结果经Kruskal-Wallis秩和检验差异有统计学意义(P＜0.001)(见表2)。

趾间型毛癣菌和苯海姆节皮菌对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、环吡酮胺和灰黄霉素的药物敏感性差异有统计学意义 (P＜0.001)。对特比萘芬、阿莫罗芬和联苯苄唑的药物敏感性差异无统计学意义 (见表3)。

表2 不同抗真菌药物药敏试验MIC的平均秩次比较结果Tab.2 The MICs of different antifungal agents against Trichophyton mentagrophytes

表3 不同菌株之间抗真菌药物药敏试验MIC的平均秩次比较结果Tab.3 The MICs of different antifungal agents against T.interdigitale and A.benhamiae

3 讨论

2003年美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS，2005年1月才改为CLSI)提出了新的产孢丝状真菌NCCLS药敏试验方法即M38-A方案，但该方案主要针对非皮肤癣菌设计。在经过多次协作试验之后，该委员会于2008年又提出了M38-A2方案，M38-A2方案在一系列一致试验的基础上给出了皮肤癣菌的试验方法。

皮肤癣菌的生物学特性不同于曲霉、镰刀霉等产孢丰富的丝状真菌，其生长对数期较长，为10～14 d，最适生长温度为27℃，菌丝较长，有分隔，产孢少，因此药敏试验的关键在于菌悬液的制备。M38-A2方案中对于皮肤癣菌菌悬液终浓度规定为(2～6)×103CFU/mL，方案中提出用约1 mL的无菌0.85%盐水覆盖菌落，轻轻用移液器尖端或无菌拭子摩擦菌落制成菌悬液。使菌悬液沉淀5～10 min，用血细胞计数器计数孢子，并调整到所需浓度。但在实际应用中，往往出现长菌丝较多，易带入培养基，孢子数较少而难于计数的情况。本实验室曾经采用研磨的方法，使较长菌丝变短来制备菌悬液，也有很多研究采用特殊培养基及多次纯培养促进分生孢子大量产生［1］，但这些方法均过于费时繁琐。本试验用1 mL的生理盐水直接冲打菌落表面后，用巴氏吸管轻轻抽吸后，将有孢子和菌丝片断的菌悬液吸到尖端开口并带滤纸的高压消毒EP管后渗漏至另一无菌EP管，此过程类似于San-tos等［2］采用的滤过菌丝方法，然后移液管转入比浊管，用比浊仪调整菌悬液浓度至 (2～3)×105CFU/mL，相当于比浊仪为0.2～0.3麦氏单位处，并用血细胞计数板计数验证达(2～3)×105CFU/mL。抽取菌悬液稀释后接种计数，发现菌量符合方案对皮肤癣菌接种量的要求。用此方法得到的菌悬液既保证接种液不含培养基，又滤过了较长粗大菌丝而便于孢子计数和比浊，在今后的工作中或只需要菌悬液滤过后比浊即可达到所需浓度。此种改良方法测得MIC值与原方案测得MIC值一致，简单、快速、操作性强，适合于临床实验室推广。

本实验的MIC结果比较显示，不同抗真菌药物对须癣毛癣菌的药敏结果差异有显著的统计学意义(P＜0.001)。趾间型毛癣菌和苯海姆节皮菌对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、环吡酮胺和灰黄霉素的药物敏感性差异有统计学意义 (P＜0.05)。对特比萘芬、阿莫罗芬和联苯苄唑的药物敏感性差异无统计学意义(P＞0.05)。唑类药物如氟康唑、伊曲康唑、联苯苄唑是目前应用比较广泛的抗真菌药，我们实验中显示唑类药物对须癣毛癣菌是敏感的，这和Maria等［3］的结果相似。伊曲康唑和联苯苄唑MIC均值在0.3μg/mL左右，MIC90为0.5μg/mL左右;但氟康唑MIC值较高，其与临床疗效的关系尚需依药代动力学特性而定。伏立康唑目前临床主要用于治疗系统性真菌感染，本实验结果 MIC 均值为 0.04 μg/mL，MIC90为 0.125 μg/mL，和文献［4］相一致，显示出对须癣毛癣菌较好的体外抑菌活性。这些实验结果为临床用药提供了一定的参考价值。特比萘芬、阿莫罗芬均为杀菌剂［5］，MIC 值较低，MIC90分别为0.003 8 μg/mL和0.25μg/mL，而且在对趾间型毛癣菌和苯海姆节皮菌作用上差异无统计学意义，提示临床上即使对须癣毛癣菌复合体不能进一步种内鉴定时，治疗上这两种药物可供优先选择。M38-A2方案中未规定联苯苄唑和阿莫罗芬的判定终点，我们采用和对照相比80%受抑制作为MIC判定标准，重复试验显示结果稳定。另外，本研究中氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、环吡酮胺和灰黄霉素等抗真菌药物对趾间型毛癣菌MIC值要低于对苯海姆节皮菌的MIC值，是否提示以狐狸为宿主的苯海姆节皮菌活力更强需要进一步验证。药敏试验显示，苯海姆节皮菌对氟康唑和伊曲康唑的MIC值均较高，可能出现不敏感现象，提示狐狸毛为宿主的苯海姆节皮菌一旦感染人类，在药物选择上要多加注意。

本研究完全按照M38-A2方案的步骤对同一实验菌株实施2次以上的体外药敏试验，所得MIC值结果基本相同，验证了M38-A2方案的稳定性和可重复性。本实验中质控株为近平滑念珠菌ATCC22019和须癣毛癣菌ATCCMYA4439，所有药敏试验批次均设质控，保证了同等条件下结果的一致性，从而保证了结果的可信性。

致谢:新疆医科大学一附院、中山大学第二医院、复旦大学华山医院、四川大学华西医院、大连医科大学第一附属医院、中国农业大学动物医院、中国医学科学院皮肤病研究所、河北医科大学第四医院等单位真菌室馈赠菌株。

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