LC-MS/MS技术同时测定滋心阴口服液中6种化学成分

乔 湜， 石 蕊， 蒋午峻， 卢树杰， 王 巧*， 张兰桐

(1.河北医科大学药学院药物分析教研室，河北石家庄 050017;2.河北省中药注射剂工程技术研究中心，河北石家庄 051430)

滋心阴口服液是由北沙参、赤芍、麦冬、三七四味中药加工而成的一种中药复方制剂［1］，具有滋养心阴、活血止痛之功效［2-3］。有关其质量控制的报道主要集中在芍药苷单一成分的高效液相色谱法(HPLC)测定［4-5］。《中国药典》(2010 版)也仅对滋心阴口服液中芍药苷进行了HPLC法含量测定，且样品的前处理较繁琐。液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)［6-8］具有专属、快速、灵敏等优点，是混合物中化学成分定性和定量分析的有力工具。本研究即采用HPLC-MS法对滋心阴口服液中芍药苷、芍药内酯苷2种苷类成分和花椒毒素、补骨脂素、异茴芹内酯、佛手柑内酯4种香豆素类成分进行了含量测定，以期为其质量控制提供新方法。

1 仪器与试剂

3200Q-Trap质谱仪(美国AB公司)，配有三重四级杆线性离子阱质量分析器和Toubo V电喷雾离子源;Agilent1200液相色谱仪(美国Agilent公司)，配有四元梯度洗脱泵，自动进样器和在线脱气机;Analyst 1.4.2分析软件(美国应用生物系统公司);BP211D型电子分析天平(德国 Satrorius公司);LG16-B型离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)。

甲醇(色谱纯，美国迪马公司);甲酸(色谱纯，美国迪马公司);纯净水(杭州娃哈哈集团有限责任公司)。

对照品芍药苷(批号:110736-200629)和补骨脂素(批号:110739-200613)，均购自中国药品生物制品检定所;芍药内酯苷(深圳市美荷生物科技有限公司，含量大于98%)，花椒毒素、异茴芹内酯和佛手柑内酯(上海同田生物技术有限公司，含量大于98%);滋心阴口服液(湖北福人金身药业有限公司，批号:20090401041，20090804141，20091003118，20100102111)。

2 方法与结果

2.1 色谱和质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18column(150 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇(A)和0.1‰甲酸-水(B)，梯度洗脱，洗脱程序如下:0～4 min，40% ～95%A;4 ～7 min，保持 95%A不变;7～7.5 min，95% ～40%A。柱温:室温，流速:0.8 mL/min，进样量:10 μL。

2.1.2 质谱条件 离子源:电喷雾离子(ESI)源;检测方式:多反应监测(MRM)模式;采用正负离子同时监测，0～5 min采用负离子模式，用于芍药内酯和芍药苷的测定，5～7.5 min采用正离子模式，用于花椒毒素、补骨脂素、异茴芹内酯和佛手柑内酯的测定;源喷射电压:5 500/－4 500 V;源温度(TEM):650℃;帘气(CUR):20 psi;雾化气(gas 1):60 psi，加热气(gas 2):65 psi，均为氮气。6种被测成分监测离子对、解簇电压(DP)和碰撞电压(CE)见表1，二级质谱图见图1。

表1 滋心阴口服液中6种化学成分的保留时间、监测离子与主要质谱参数Table 1 The retention time(tR)，MS/MS fragment ions and main mass parameters of the 6 analytes in Zixinyin Oral Liquid

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液制备 精密量取滋心阴口服液2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇-水(40∶60)至刻度，摇匀。离心(转速10 000 r/min)10 min，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.2.2 对照品溶液 精密称取对照品芍药内酯苷、芍药苷、花椒毒素、补骨脂素、异茴芹内酯和佛手柑内酯适量，分别置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，得贮备液。精密量取上述各贮备液适量于10 mL量瓶中，加甲醇-水(40∶60)稀释至刻度，摇匀，即得芍药内酯苷、芍药苷、花椒毒素、补骨脂素、异茴芹内酯和佛手柑内酯的混合对照品溶液，浓度分别为 64.410，993.680，1.800，0.570，0.625 μg/mL 和 0.366 μg/mL。

图1 对照品二级离子扫描质谱图A.芍药内酯苷 B.芍药苷 C.花椒毒素 D.补骨脂素 E.异茴芹内酯 F.佛手柑内酯Fig.1 Product ion scan spectra of the standardsA.albiflorin B.paeoniflorin C.xanthotoxin D.psoralen E.isopimpinellin F.bergapten

2.2.3 阴性对照溶液 芍药内酯苷和芍药苷，花椒毒素、补骨脂素、异茴芹内酯和佛手柑内酯分别来源于赤芍和北沙参药材，按照处方比例及工艺，分别制备缺少赤芍和北沙参药材的阴性对照样品，并按2.2.1项下供试品溶液制备方法制备各阴性对照溶液。

2.3 专属性试验 取各阴性对照溶液和供试品溶液，按2.1项下色谱和质谱条件进行分析，由HPLC色谱图(见图2)可知，两种阴性对照溶液中均未检测到干扰成分，表明方法专属性良好。

2.4 标准曲线、检测限和定量限 精密量取混合对照品溶液2.5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇-水(40∶60)稀释至刻度，浓度分别为:芍药内酯苷16.102 μg/mL，芍药苷 248.420 μg/mL，花椒毒素 0.450 μg/mL，补骨脂素0.143 μg/mL，异茴芹内酯 0.156 μg/mL和佛手柑内酯0.092 μg/mL，依次逐级稀释2倍，定容，制得6个浓度梯度的系列标准溶液，按2.1项下色谱和质谱条件进行分析，记录峰面积。以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线并进行一元线性回归，得标准曲线方程(见表2)。将混合对照品溶液逐步稀释，分别以信噪比S/N=10和S/N=3时各对照品的量作为定量限和检测限，结果见表2。

表2 滋心阴口服液中6种化学成分的标准曲线方程、检测限和定量限Tab.2 Linear regression data，LODs and LOQs of the six analytes in Zixinyin Oral Liquid

2.5 仪器重复性试验 取混合标准溶液，浓度分别为:芍药内酯苷 4.026 μg/mL，芍药苷 62.105 μg/mL，花椒毒素 0.113 μg/mL，补骨脂素 0.036 μg/mL，异茴芹内酯0.039 μg/mL和佛手柑内酯0.023 μg/mL，按2.1项下色谱和质谱条件重复进样6次，记录6种成分的峰面积，得RSD值分别为0.21%、0.33%、0.49%、0.22%、0.34%和0.57%。

2.6 精密度试验 取同一批滋心阴口服液，制备供试品溶液6份，分别测定，芍药内酯苷、芍药苷、花椒毒素、补骨脂素、异茴芹内酯和佛手柑内酯6次测定结果的RSD值分别为1.4%、1.1%、1.8%、1.1%、1.3%和3.0%。

2.7 回收率试验 精密量取同一批滋心阴口服液1 mL共6份，分别置10 mL量瓶中，精密加入混合对照品溶液适量，用甲醇-水(40∶60)稀释至刻度。按2.2.1项下操作，制备供试品溶液，测定6种化合物的峰面积，计算回收率。测定结果见表3。

表3 回收率测定结果(n=6)Tab.3 The method recoveries for six analytes(n=6)

2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在室温下放置 0、2、4、6、8、10、12 h 时进行测定，芍药内酯苷、芍药苷、花椒毒素、补骨脂素、异茴芹内酯和佛手柑内酯峰面积的RSD值分别为1.2%、1.3%、0.60%、0.50%、1.1%和0.70%，表明供试品室温放置12 h内稳定。

2.9 样品测定 取4批滋心阴口服液，制备供试品溶液，进行分析，根据标准曲线计算6种成分的含 量，结果见表4。

表4 滋心阴口服液中6种化学成分含量测定结果(n=3)Tab.4 The contents of six analytes in Zixinyin Oral Liquid samples(n=3)

3 讨论

一级全扫描质谱图中发现，芍药苷和芍药内酯苷在负离子检测模式下分别易产生加合离子峰［M+HCOO］－和准分子离子峰［M －H］－，而花椒毒素、佛手柑内酯、异茴芹内酯和补骨脂素在正离子模式下易产生准分子离子峰［M+H］+。本实验采用正负离子同时检测，既保证了检测的灵敏度和稳定性，又提高了工作效率。

分别考察了流动相中加入3种不同的电解质甲酸、乙酸以及醋酸铵对化合物响应值的影响，发现加入甲酸后响应值和峰形优于乙酸和醋酸铵。对甲酸的比例进一步考察，发现0.1‰甲酸能够达到最佳的分离效果和稳定的响应值，故以甲醇和0.1‰甲酸水作为流动相梯度洗脱，6种被分析物在7.5 min内全部出峰，而且不受其他化合物的干扰。

滋心阴口服液中北沙参具有滋阴功效，赤芍具有活血功效。因此，本实验选择北沙参中的花椒毒素、佛手柑内酯、异茴芹内酯和补骨脂素以及赤芍中的芍药苷和芍药内酯苷作为定量指标。对北沙参的成分欧前胡素和异欧前胡素也进行了监测，但未检测到该两种物质，推测可能与滋心阴口服液的制备工艺有关。

目前，HPLC-UV法［9-11］常用于中药及其制剂的质量控制，然而对于这一复杂体系的分析，采用HPLC-MS法则表现出更多的优越性。HPLC-MS法不要求被测成分完全分离，且具有更高的专属性和灵敏度。本实验中花椒毒素和补骨脂素的保留时间相同，但因MRM扫描模式监测的离子对不同(分别为217.1/202.1和187.2/131.1)，即可使两种成分在同时洗脱的情况下分别准确定量，避免了繁琐的色谱分离条件考察过程，且分析时间也明显缩短，本实验中每个样品的分析时间仅为7.5 min。

本研究采用HPLC-MS方法对滋心阴口服液中6种成分进行了同时测定，方法快速、准确，为滋心阴口服液的质量控制提供了新手段，同时HPLC-MS的应用，也为专属、有效的中药现代质量控制体系的建立提供了一个可行的方向。

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