桡动脉体外药物敏感模型的建立

祝岩，王辉山，李新民，汪曾炜

（沈阳军区总医院心脏血管外科，沈阳 110016）

桡动脉在全动脉化冠脉搭桥（coronary artery bypassgraft，CABG）手术中占有越来越重要的位置，但是桡动脉易于痉挛，影响患者术后桥血管近期和远期通畅率。防治桥血管痉挛、保持桥血管的通畅成了临床科研工作中一项重要内容。在体内研究血管组织收缩痉挛的病因、机制和防治措施，容易受到体内神经－体液以及各种药物等多方面的影响。我们利用组织浴槽建立桥血管体外药物敏感模型，研究单一因素改变对血管舒缩状态的影响，取得了比较满意的结果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桡动脉供体12例，全部为男性，年龄18~43岁，平均（29.5±10.7）岁，均无高血压、糖尿病、心肌梗死等疾病。心功能（NYHA分级）均为I级。血管采集前2周内未接受任何药物治疗。取材时常规应用“notouch”技术，尽量避免动脉痉挛。阻断血流或离断血管后10 min内获得目标血管，仔细观察目标血管壁没有动脉粥样硬化性改变或者其他肉眼可见的疾病。立即保存在4℃Krebs-Ringer重碳酸盐缓冲液中。低温下简单整理血管后，送往实验室进行实验。实验所需苯肾上腺素、乙酰胆碱购自美国Sigma公司；Krebs-Ringer组织浴槽灌流缓冲液由沈阳军区总医院制剂室提供。

1.2 模型制备

血管被送到实验室后，继续浸泡在4℃Krebs-Ringer液中，持续通入95%O2和5%CO2。整理桡动脉使其骨骼化，然后将目标血管切割成3~4 mm宽的血管环，要求务必保留血管内膜。用两根不封口的三角形钢丝相对方向分别穿过切好的血管环，钢丝两端牵引并在10 ml麦式组织浴槽（上海第三分析仪器厂）中水浴（图1）。持续充入95%O2和5%CO2，调节温度为37°C、pH7.4。钢丝的一端连接静息张力－位移探测换能器（San 45196-A型，日本NECSan Instrument公司），用以连续记录等长静息张力的变化。换能器另一端连接到多道生理信息采集处理系统（San 362型，日本NECSan Instrument公司）上，并通过生理信息记录软件（MEDLAB 6.0版）量化，以记录实验数据。钢丝的另一端固定于可以精细调节被动张力的装置上。给血管环加一个2.5~3.0 g的前负荷（由血管环自身的张力曲线确定，此张力下血管环不再继续伸展，已经达到固有圆周数值的90%）。缓冲液每间隔15 min冲洗组织浴槽一次，直至所有血管环达到最佳静息张力，维持相对稳定的长度。Krebs-Ringer液基本成分及其浓度为：NaCl 118 mmol/L，KCl 4.9 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，KH2PO31.2 mmol/L，葡萄糖 5.5 mmol/L，EDTA 0.03 mmol/L。

2 结果

2.1 检测血管环收缩活性

水浴槽中的血管环平台期出现后，向组织浴槽中加入KCl溶液，直至水浴槽中K+终浓度为60 mmol/L，血管环产生明显收缩证明血管环管壁平滑肌收缩活性良好，反之则弃之不用。量化血管环收缩力后，用缓冲液反复冲洗组织浴槽去除K+，待血管环恢复最初的舒张状态后，再多次加入上述KCl溶液重复上述实验过程，直至血管环连续2次的收缩幅度（产生静息张力大小）相差在10%以内，证明血管环已经稳定，进入下一步实验。

2.2 评估内膜组织的完整性试验

已经确定处于平衡稳定状态下的血管环，排除其他会导致血管环收缩的影响因素。向组织浴槽中加入终浓度为10μmol/L苯肾上腺素，血管环产生收缩，待收缩稳定后，再加入终浓度为20μmol/L内膜依赖性的血管舒张剂乙酰胆碱，血管环开始舒张。血管环的舒张程度达到上述平衡状态下静息程度的80%以上，认为其内膜是完整的或者说内皮功能是完好的，可以继续下面的实验。

2.3 绘制苯肾上腺素浓度－静息张力收缩曲线

向组织浴槽中加入苯肾上腺素，使浴槽内液体终浓度达到0.1μmol/L，可以观察到血管环产生一定的等长收缩，静息张力加大。以－log M整倍数逐渐加大肾上腺素药物的浓度，直至收缩程度不再增加，同时记录此过程血管环的药物浓度－静息张力曲线（图2）。可知当苯肾上腺素浓度达到1 mmol/L时血管环产生完全收缩。再次用缓冲液将水槽冲洗干净或者加入乙酰胆碱，血管环应该可以逐渐舒张，恢复至初始条件下的静息张力。以苯肾上腺素不同半对数克分子浓度为横轴，血管环在对应浓度下产生的静息张力为纵轴，多个血管环静息张力取平均值，绘制苯肾上腺素浓度－静息张力收缩曲线。

图1 麦氏水浴槽连接装置及血管环挂钩Fig.1 C onnecting device of organ chamber and hanger for radial artery rings

图2 桡动脉苯肾上腺素浓度－静息张力收缩曲线Fig.2 Mean concentration-contraction curves for M O in human radial artery rings

上述所有药品均事先溶解于蒸馏水中，制备成母液，逐渐加入，研究中所有涉及的浓度均经过计算，已经考虑了添加液体对水浴管最终浓度的影响。药物以半对数克分子浓度为梯度逐渐增加，下一个浓度增加的时机选择在上个浓度梯度产生的收缩平稳到达平台期后，或者血管不产生新的静息张力10 min后，直至血管环达到最大程度的收缩。

3 讨论

随着全动脉化CABG手术在全球范围内的逐渐开展，桡动脉因为其管径适当、远期通畅率高、长期效果好，作为桥血管的应用而日益受到重视。但是桡动脉容易受到环境刺激、药物作用等多方面的影响而极易发生痉挛，影响和限制了临床上的广泛应用。预防和治疗桡动脉痉挛，保持管腔通畅，提高桡动脉近、远期通畅率就成了当前临床科研工作的一大热点。人体血管组织在体内处于复杂多变的内环境中，不可避免的受到来自神经、体液、内分泌因子、甚至围术期应用的各种血管活性药物等多方面的作用和影响。因此在体研究血管组织收缩痉挛的病因、机制和防治措施，不能保证单独一项或者几项实验影响因素对血管壁的作用，相互之间的可比性难以判断。在体桡动脉的实验研究也不符合医学伦理要求。我们借鉴药理学实验中的组织浴槽，利用它可以比较完善的模仿体内内环境单一因素改变对血管舒缩状态的影响。并且为了能够在最大程度上保证实验的严谨和可重复性，我们要求在实验每一步开始前和结束后都要进行血管环收缩和舒张活性的检测以及血管内膜完整性的检测。

有研究证明桡动脉在血管分类上属于Ⅱ类血管，也就是具有α肾上腺素受体的肌性动脉血管，其血管收缩主要依赖血管壁上的α受体调节，β受体分布较少［1］。因此我们在实验中选用了主要激动α1受体的苯肾上腺素。由我们绘制的苯肾上腺素浓度－静息张力收缩曲线可知，桡动脉在浓度为1 mmol/L苯肾上腺素的作用下可以产生完全收缩，该浓度远大于在人体内的治疗浓度。我们确定采用半对数克分子浓度（E50），即以10μmol/L作为标准。在本课题的后续实验中，以此浓度作为刺激血管收缩的标准浓度，以便观察血管环在不同药物作用或预处理后的血管收缩反应，找到防治血管环痉挛的最佳方法。

与其他Ⅱ类动脉血管相似，桡动脉更容易产生痉挛。体外实验证明，桡动脉对血管收缩药物的反应性远较胸廓内动脉或者大隐静脉敏感［2］。首先，桡动脉血管壁α受体密度远远高于胸廓内动脉的血管壁，因而桡动脉较胸廓内动脉更容易受到α受体兴奋剂的影响产生收缩性。Chardigny等［3］发现桡动脉与胸廓内动脉相比，前者对去甲肾上腺素有更强的收缩反应。第二，接受CABG手术患者在围术期内环境常常出现儿茶酚氨类物质或者其他收缩血管介质释放增多的现象，可为正常时的3~4倍，这种增高一般至少会持续24 h。再加上手术中常用的外源性血管收缩药物如去甲肾上腺素、苯肾上腺素、大剂量的多巴胺等，都可以引起桡动脉血管的进一步收缩或者痉挛。最近有研究表明，起收缩主导作用的肾上腺受体为受体α1很少为α2，强调了人类桡动脉中α1受体功能研究的重要性［4］。第三，桡动脉还是一个厚壁、肌性的血管，平均厚度为500μm，而胸廓内动脉厚度仅为300μm［5］。桡动脉血管中层较其他血管中层明显厚，因而产生的痉挛更加强烈并且难于恢复。桡动脉管壁有着更高的平滑肌细胞密度，平滑肌细胞分为数层，紧密连接在一起；胸廓内动脉的平滑肌细胞则较为松散的连接在一起，所以桡动脉具有更大的可收缩性［6］。第四，作为桥血管，桡动脉是没有神经支配的血管，去神经使动脉血管壁对肾上腺素受体的刺激更加敏感，因此对α受体有更强的反应性［7］。第五，桡动脉血管壁内一氧化氮含量较其他动脉血管少［8］。这样CABG手术中明显增加的各种血管活性因子更强的作用于桡动脉使之痉挛也就不难理解了。鉴于受体介导是桡动脉痉挛的主要原因，在本研究中我们采用的血管痉挛药是苯肾上腺素，其调节血管活动所作用的是肾上腺受体中最为重要的α1受体。几乎所有的血管平滑肌都含有α1受体。平滑肌细胞α1受体激动时通过Gq/11蛋白→磷脂酶C激活→细胞内游离的Ca2+增多与蛋白激酶C激活而引起血管平滑肌收缩。人们在研究血管环恒流灌注模型中发现，血管α1-AR激动时信号转导具有钙依赖特性。细胞内游离Ca2+增加约90%来自细胞外Ca2+，通过敏感的电压依赖性Ca2+通道内流。肌性动脉（如桡动脉）与弹性动脉比较有更多的α1肾上腺能受体，能更容易地引起血管收缩。

国外此类相关试验中采用的血管痉挛药是高钾，其机制是直接兴奋细胞膜电压门控通道钙离子泵，促进Ca2+内流，最终导致Ca2+增多与蛋白激酶C激活而引起血管平滑肌收缩。这种刺激方式忽略了动脉血管壁上α受体对血管舒缩状态的调剂作用，虽然方式比较简单，但我们认为在实验中应用受体介导的血管收缩更有临床意义。

［1］He GW，Yang CQ.Characteristics of adrenoreceptors in the human radial artery：clinical implications［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，1998，115（5）：1136－1141.

［2］Hamilton CA，O’Dowd G，McIntosh L，et al.Vasorelaxant properties of isolated human radial arteries：comparison with internal mammary arteries［J］.Atherosclerosis，2002，160（2）：345－353.

［3］Chardigny C，Jebara VA，Acar C，et al.Vasoreactivity of the radial artery.Comparison with theinternal mammary and gastroepiploic arterieswith implications for coronary artery surgery［J］.Circulation，1993，88（5 Pt 2）：115－127.

［4］Stojnic N，Bukarica LG，Peric M，et al.Analysis of vasoreactivity of isolated human radial artery［J］.JPharmacol Sci，2006，100（1）：34－40.

［5］Desai ND，Cohen EA，Naylor CD，et al.A randomized comparison of radial-artery and saphenous-vein coronary bypassgrafts［J］.NEngl J Med，2004，351（22）：2302－2309.

［6］Chester AH，Marchbank AJ，Borland JA，et al.Comparison of the morphologic and vascular reactivity of the proximal and distal radial artery［J］.Ann Thorac Surg，1998，66（6）：1972－1977.

［7］Zhang Y，Janssen L，Chu FV.Atherosclerosis of radial arterial graft may increasethepotential of vessel spasmin coronary bypass surgery［J］.JThorac Cardiovasc Surg，2005，130（5）：1477－1478.

［8］Chester AH，Amrani M，Borland JAA.Vascular biology of the radial artery［J］.Curr Opin Cardiol，1998，13（6）：447－452.