印度墨汁灌注观察兔股骨头血运

郭月超，王恩波，赵群，吉士俊，张立军

（中国医科大学附属盛京医院小儿骨科，沈阳 110004）

动物实验中，通过墨汁灌注方法对组织血运的观察是一种操作简单、成本低廉、效果明显的方法。目前广泛应用于动物脑组织、内脏及眼底的微循环灌注［1，2］。现将墨汁灌注的方法应用于兔股骨头，观察兔股骨头灌注效果，经过反复实验，

取得良好的效果。

1 材料与方法

1.1材料

动物：日本大耳白兔10只，6周龄，体质量0.8~1.0 kg。由中国医科大学动物部提供。印度墨汁原液：印度墨汁由上海宝曼华蓝公司提供。

1.2方法

1.2.1 明胶墨汁的配制：分别将3、5、10 g明胶溶于100 mL蒸馏水中，制成3%、5%、10%明胶溶液，于60℃温箱中1 h后完全溶解。室温下观察，3%明胶溶液呈胶冻状，较软，震动时易碎；10%明胶溶液呈固态，剧烈震动下形态稳定；5%明胶溶液介于两者之间。将1 mL印度墨汁原液分别溶于1 mL、2 mL、3 mL、4 mL蒸馏水中稀释，用棉签蘸少许墨汁涂于白纸上对比观察。印度墨汁原液涂色均匀一致；1∶1稀释液稍有不均匀；1∶2稀释液深浅不均匀明显；1∶3稀释液可见灰色涂色区有少量黑色痕迹。根据以上实验，配制明胶墨汁的比例为10 g明胶∶50 mL印度墨汁∶50 mL蒸馏水，配制成10%明胶墨汁，于60℃温箱中备用。

1.2.2 固定液及冲洗液的配制：固定液采用4%多聚甲醛，于60℃温箱中过夜备用。冲洗液采用12 500 U肝素溶于500 mL生理盐水中，放入37℃温箱中备用。

1.2.3 明胶墨汁灌注方法和步骤：（1）麻醉：5%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射，麻醉成功后将兔仰卧位固定，下肢固定时使用胶带固定，勿用绷带直接系住下肢，以免影响血运。（2）插管：沿腹中线开口，充分暴露腹主动脉及下腔静脉。将腹主动脉和下腔静脉各游离1~2 cm，结扎近心端，向腹主动脉远心端插入套管针，丝线固定，作为灌注口。下腔静脉结扎远端剪开一5 mm小口，作为引流口。（3）灌注：将37℃肝素生理盐水从灌注口注入兔腹主动脉内冲洗血管，直至引流口流出清亮液体为止。将60℃4%多聚甲醛从灌注口注入，当兔出现全身痉挛时即可停止。再将60℃10%明胶墨汁在90 mmHg［1］压力按20 mL/kg从灌注口注入，见兔双下肢皮肤及爪尖变黑，引流口亦有墨汁流出。灌注结束后立即结扎腹主动脉及下腔静脉远心端，防止墨汁再流出。关腹，立即放入-20℃冰箱中冷冻6 h。

1.2.4 取材及切片：将冷冻好的兔股骨头及髋臼一同取下，放入4%多聚甲醛固定5 d。固定后放入20%甲酸中脱钙2周，蒸馏水冲洗24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋。行冠状面切片，片厚分别为5μm、10μm、20μm、40μm。常规脱蜡，HE染色，脱水，封片。

2 结果

2.1 大体观察：灌注墨汁时兔皮肤毛细血管网清晰可见成黑色（图1）。髋关节冠状面可见股骨头骨骺、股骨近端、大转子、髋臼及关节囊被染成黑色，股骨头软骨及生长板颜色变深（图 2）。

2.2 光镜观察：见10只兔股骨头病理片中均清楚显示股骨头骨骺内黑色墨汁。切片越厚墨汁越清晰，但组织结构和细胞层次越模糊。对比以上各厚度病理片，厚度为10μm较合适，既能在低倍镜下清楚看清黑色墨汁，又能清楚显示细胞层次（图3）。而且黑色墨汁和组织分界清楚，墨汁并不会影响骨骺软骨和生长板结构的观察。

3 讨论

观察股骨头血运的方法临床上多采用DSA、ECT或MRI等方法。在动物实验中上述方法因成本高、动物股骨头小等因素受到限制。墨汁灌注已经广泛已经广泛应用于动物组织灌注［2~4］。明胶是一种水溶性蛋白质混合物，可溶于35~40℃水，增加水的粘度和稳定性。根据明胶与水的比例不同，常温下可成胶冻状或固态。印度墨较颗粒细小，并且含有组织胶成分，可以牢固的对组织进行染色，不会在冲洗过程中被洗掉。事实证明，在标本脱钙、冲洗、浸蜡及烤片过程中，脱钙液及蒸馏水保持清亮透明，无墨汁脱落现象。

图1 灌注墨汁（绿箭头：血管变黑）

图2 股骨头冠状面

图3 HEX20股骨头骨骺内黑色墨汁

我们将墨汁灌注的方法应用于股骨头血运的观察，在反复实验中得到以下体会：（1）60℃多聚甲醛可以使血管在扩张状态下对组织和血管进行良好的固定，防止细胞溶解；（2）10%明胶墨汁在室温下呈胶冻状，不会透过血管壁或细胞壁影响其他组织的观察；（3）从腹主动脉灌注，下腔静脉引流使灌注过程不经过心脏，保证动物处于存活状态进行实验，避免了因动物死亡造成的体温下降、血管痉挛等影响因素；（4）软组织的墨汁灌注在切片时需要切50~100μm甚至更厚的病理片才能清楚看到整根血管。股骨头的墨汁灌注，因骨骺中为血窦成分，不存在整根血管，故切片时只需切10μm既能清楚显示黑色墨汁，又能清楚分清细胞层次。（5）以往的文献报道中认为墨汁灌注时尽量充分灌注，才能使血管显示完全，易于观察［2，5］。我们认为，股骨头血运特殊，骨骺内为血窦，相互通连，故不应过度灌注墨汁，应处于灌注不饱和状态，才能正确比较股骨头血运受阻时墨汁灌注量的变化。但应注意灌注时压力应接近动物平均动脉压，压力过高会造成灌注过度；灌注量应与动物体质量成相同的比例，对于兔而言20 ml/kg接近饱和状态。（6）股骨头骨骺内无法进行血管

数量统计，但可以通过测量面积表示血运情况，进行定量分析。即在10μm薄片中通过图像分析软件测量出骨骺内黑色墨汁面积和股骨头骨骺面积，两个面积的比值为灌注量，这样可以避免单纯计算面积时兔股骨头发育大小的影像，在显微观察下为股骨头血运的定量分析提供了科学可靠的方法。

［1］赫光荣.实验动物学［M］.上海：第二军医大学出版社，2005：263.

［2］李郎，孙俊，李明，等.加温灌注明胶墨汁制作动物脑血管模型的方法［J］.中国临床解剖学杂志，2004，22（2）：224.

［3］童建斌，曾乐平，陈旦，等.明胶墨汁灌注展示大鼠视网膜血管的方法［J］.第三军医大学学报，2007，29（21）：2031-2033.

［4］Taguchi Y，Takashima S，SasaharaE，et al.Morphological changes in capillariesin theischemic brain in Wistar rats［J］.Arch Histol Cytol，2004，67（3）：253-261.

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