散发性阿尔茨海默病早老素2基因的新突变

白云峰，田菊，权文香，，前田潔

（1.解放军第302医院中西医结合肝病诊疗与研究中心一科，北京 100039；2.北京大学第六医院生化室，北京 100191； 3.日本神户大学医学系研究科精神神经科，日本 神户 6500017）

阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）是一种渐进性神经变性疾病，分为家族性AD（FAD）和散发性AD（SAD）两种类型，其中SAD占多数。在欧洲SAD的比例为50%~75%，在日本SAD占80%~90%。目前为止有3种AD的致病基因：β淀粉样蛋白前体（APP）、早老素 1（presenilin-1，PSEN1）和早老素 2（PSEN2）。FAD 大多与 PSEN1、APP 基因突变有关，极少数与PSEN2基因突变有关。迄今为止，世界范围内共发现与FAD相关的PSEN1基因突变有164个，与SAD相关的PSEN1基因突变有3个。与PSEN1基因同源性的PSEN2基因中也有11种基因突变的报道，10种基因突变与FAD相关，1种基因突变与SAD相关。ApoE是SAD和晚发性FAD的易感基因，ApoE等位基因ε4是SAD的主要遗传风险因子［1］，然而携带APOEε4的SAD患者并不一定发病，所以可能还存在其他遗传风险因子。我们为了进一步探讨SAD与PSEN2基因突变的相关性，进行了日本人群中PSEN2基因的序列测序。

1 材料与方法

1.1 材料来源

300例患者来自日本神户大学附属医院精神神经科门诊。其中男120例，女180例，年龄56~92岁，平均（72.57±7.56）岁。入组患者均进行常规检查、脑电图、MRI检查，MRI检查显示内颞叶结构萎缩，包括海马结构、杏仁核和内嗅皮质［2，3］。并根据NINCDS/ADRDA统一标准确立为很可能的AD［4］，患者或知情者诉有超过6个月的缓慢进行性记忆减退，测试发现有严重的情景记忆损害的客观证据，主要为回忆受损，通过暗示或再认测试不能显著改善或恢复正常，全部患者无阳性家族史。并用简易智能量表（MMSE）进行认知能力评估，评分≤24分者被选入组。对照组300例来自社区随机抽样。其中男120例，女180例，年龄55~94岁，平均（70.97±6.73）岁；进行神经系统检查及MRI检查均正常者被选入组，并且MMSE得分≥28分。此研究经日本神户大学医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及PCR：提取所有受试者的周围血5 ml，用基因组DNA提取试剂盒从外周血的白细胞中提取基因组DNA。用PCR方法进行PSEN2基因外显子区域的扩增。正向引物及反向引物见表1。用Takara DNA多聚酶进行PCR。反应体系30μL：包括100ng基因组DNA 1μL、30pmol/L的引物各1μL、3μL的 10×PCR 缓冲液、0.2 mmol/L的dNTP 3μL、1U的Takara Taq DNA多聚酶0.15μL。PCR反应条件为：95℃变性9 min后，进入主循环；95℃30 s、各外显子PCR的不同退火温度30 s、72℃1 min共35个循环后72℃延伸10 min。外显子2的PCR退火温度为65℃，外显子4的PCR退火温度为56℃，其他外显子PCR的退火温度为60℃。取PCR产物5μL在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，之后用EB染色并在紫外线下观察结果。

1.2.2 碱基序列测序：采取直接测序PCR产物，首先用PCR纯化试剂盒（Qiagen，USA）纯化25μL的PCR产物，然后进行碱基序列的测序反应（用PCR引物），反应体系为20μL；包括纯化PCR产物1 μL，10 pmol/L的单向引物2μL，BigDye Terminator1.1的4μL，Sequence缓冲液4μL。退火温度为56℃。然后用ABI 3700基因测序仪（ABI，USA）进行测序。核酸序列经数据收集软件整理，用DNAsis2软件进行序列对比分析。

2 结果

采用12对引物（表1），对PSEN2基因的各外显子分别进行PCR及直接测序。测序300例患者组PSEN2基因序列，在3例SAD患者的外显子3上发现了100G>A基因突变，第34号密码子由甘氨酸到丝氨酸（G34S）的变化（图1），而300例对照组中没有发现此基因突变。显然，100G>A基因突变在SAD组中的频率为1%，对照组中的频率为0%。此外，在1例67岁的SAD患者PSEN2基因的外显子4上发现1915C>T基因突变，但此基因突变没有引起氨基酸编码的改变（87H）。

表1 各外显子的引物Tab.1 The primers of exons

3 讨论

图1 PSEN2基因DNA测序结果Fig.1 The results of DNA sequencing of PSEN2

PSEN2基因全长24 837 bp，位于1号染色体，有12个外显子，从第3个外显子到第12个外显子含有编码区，共2 236 bp。PSEN2蛋白是由PSEN2基因编码的448个氨基酸组成，是8次跨膜的膜蛋白质。PSEN2蛋白与其同源性的PSEN1蛋白是γ分泌酶复合体的组成之一，也是活性中心。PSEN属于天冬酰氨蛋白酶家族（aspartyl protease family），在8个跨膜结构域（transmenbrane domain，TMD）中，2个分别位于TMD6及TMD7中的天冬氨酸残基是催化剪切底物必需的活性位点（图2）。PSEN首先以无活性的全蛋白形式分泌，再经过自身催化的跨膜剪切断裂为功能性片断C端片段（CTF）和N端片段（NTF），才形成有生物功能的PSEN-NTF/CTF二聚体。除此之外，PSEN在C端保守的PAL（prolinealanine-leucine，脯氨酸-丙氨酸-亮氨酸）序列以及在第 4跨膜区中保守的 WNF（tryptophan-asparagine-phenylalanine，色氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸）序列，对于γ分泌酶的活性也很重要［5］。当PSEN蛋白异常时，会改变γ分泌酶的活性，从而导致中枢神经细胞内外产生过量的异常沉积的Aβ42，或导致 Aβ42/Aβ40 的比例失调［6］。目前PSEN2基因测序的研究中，已发现11个PSEN2基因突变，所有基因突变的表现型均为AD。

为了探索AD的致病基因，以微阵列或SNP（singlenucleotidepolymorphism）为标记检测碱基全序列的研究是目前国内外的热门。根据国际人类基因组计划已经清楚人类的全部基因，并进行了大量的基因分析，尽管这样还有很多碱基替换的报道接连不断。1995年，Sherrington等［7］发现 M146L、H163R、A246E、L286V和C410Y 5个位于PSEN1基因的突变。相继100多个PSEN1基因突变在家族性AD中陆续被报道，其中3个PSEN1基因突变是在SAD中被报道。其一是Dumanchin等［8］在法国的37岁SAD患者中发现的M139K基因突变。其二是Kamimura等［9］在日本的散发人群中发现的1例具有H163R基因突变的AD患者。这两个基因突变分别位于PSEN1蛋白CTF第5外显子的TM-II和第6外显子的HL-II，认为均具有致病性［10］。其三是Scacchi等［11］在85岁SAD患者的外显子4上发现的N32（AAT>AAC）的基因突变。该基因突变位于PSEN1蛋白的非功能区NTF，认为不具有致病性。另外，Rogaeva等［12］在家族性AD中发现了R35Q、A79V基因突变。这两种基因突变也位于PSEN1蛋白的非功能区NTF，认为与AD发病无关。

PSEN2基因分析中，Bird首次提出PSEN2基因突变会引起家族性AD。Bird报道的Volga German家系的发病原因为N141I的基因突变，其AD的平均发病年龄为58.7岁［13］。同期，Rogaev等在意大利FLO10家系中发现了具有PSEN2基因M239V基因突变的9例患者，发病年龄为45~88岁，平均50岁。可见PSEN2基因点突变有早发性AD也有晚发性AD，且外显率不是100%，同一家族里具有PSEN2基因点突变的成员不一定发病。PSEN2基因突变在SAD人群中也有报道，Cruts等在荷兰的SAD人群中发现了R62H基因突变，位于PSEN2蛋白的非功能区NTF，患者的发病年龄为62岁，在SAD中此基因突变的频率为1%，正常对照组中的频率为0%。Walker等［14］将PSEN2基因突变载体转染到神经细胞内，观察Aβ的含量。发现N141I、M239V、M239I和T122P等基因突变体的Aβ42或者Aβ42/Aβ40的比例比对照组有明显增多，但R62H、S130L、V148I、D439A 等基因突变体没有相应的变化。可见部分PSEN2基因突变可能是与AD发病无关的点突变。本文的G34S基因突变与R62H同样在SAD中被发现，同样位于PSEN2蛋白的非功能区NTF，G34S基因突变在SAD中的频率为1%，在对照组中频率为0%，曾被认为有可能与AD的发病有关［15］。G34S基因突变可能与SAD发病无关的正常多态性，但其生物学功能有待于进一步探讨。对于1915 C>T（87H）的基因突变没有引起氨基酸编码的改变，且同样位于PSEN2蛋白非功能区NTF，所以不会影响PSEN2蛋白的功能。

今后为了更多的发掘与AD相关的新的基因或者新的基因突变，有必要继续进行基因分析。在AD发病中除了显性遗传之外，还有多个基因的多重作用，并且在明确的家系中也存在非显性遗传方式遗传、或者母性遗传方式遗传的报道。更不应忽视人种差异、区域、环境、放射线等基因以外的影响。AD遗传学不像单一的显性遗传那么简单，应该是复合因子相互影响的一个复杂的问题。

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