PCR-SSCP技术分析线粒体DNA多态性及其法医学应用

张明阳，单海燕，徐冬冬，丁梅，王保捷，庞灏，周勤虎，冯春梅

（1.南通大学医学院法医学教研室，江苏 南通 2 2 6 0 0 0；2.南通大学附属医院普外科，江苏 南通 2 2 6 0 0 0；3.川北医学院法医系，四川南充 6 4 0 0 7 3；4.中国医科大学法医学院法医血清学教研室，沈阳 1 1 0 0 0 1）

人类线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是位于细胞核外的唯一遗传物质，因其拷贝数多、母系遗传、突变率高等特点而被应用于法医鉴定中，特别是对微量、陈旧、降解检材的DNA检验。单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）的突出特点是成本低，设备要求简单，周期短，适合作为基层分析的常规技术。目前mtDNA分型检测大多采用PCR直接测序法，而本文旨在探索一种简便实用的，适合于基层单位分析的mtDNA多态性检测技术。

1 材料与方法

1.1 样品

150例中国汉族无关个体的血液样品200 μL、10例尸体（死亡后12 h）的各主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、脑）0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm和5例甲醛固定石蜡包埋的组织由中国医科大学法医学院提供。血液样品和组织样品常规酚/氯仿法提取DNA，甲醛固定包埋组织醋酸铵法［1，2］提取DNA。紫外分光光度法定量，－20℃保存备用。

1.2 引物序列

根据人类mtDNA基因序列（GenBank.J01415.1），利用 Premier 5.0 设计引物，序列如下：5′GCCAGCCACCATGAATAT3′；5′AGGGTGGGTAGGT TTGTT3′。

1.3 PCR-SSCP分析

PCR反应基本条件：20 μL体系，含DNA模板2 μL（25~30 ng），上下游引物各 0.375 μmol/L，4 种dNTP 各 0.2 mmol/L，1×PCR buffer，1U Taq 聚合酶。扩增条件为：95 ℃ 3 min；94 ℃ 60 s，65 ℃ 30 s，72 ℃30 s，循环30次；最后72℃10 min；4℃保温。

取8 μL扩增产物加入6 μL SSCP载样缓冲液（95%去离子甲酰胺，5 mmol/L EDTA，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青），混匀，98℃变性15 min，然后迅速将其置于0℃冰水中10 min，取8 μL加样于预电泳30 min的非变性聚丙烯酰胺胶（T=15%，C=2%），在4℃条件下，恒压150 V电泳12 h后银染显色。

1.4 统计学分析

直接计数150份无关个体的单倍型数目，计算每种单倍型的频率。依据公式DP=［n（1-∑χ2）］/（n-1）计算个人识别率（probability of discrimination power，DP），RMP=∑χ2计算随机匹配概率（random match probability，RMP）。

2 结果

2.1 150份无关个体血样检测结果

用PCR-SSCP法获得样品清晰的单倍型图谱，中国北方汉族150份无关个体血样检出的9种单倍型（图1），各种单倍型的频数和统计结果见表1。其中单倍型Ⅸ频率最高为0.173，单倍型Ⅲ频率最低为0.040，其余各单倍型频率分布在0.067~0.147之间。

图1 9种单倍型的P A G E谱型F i g.1 P A G Ep a t t e r n s o f t h e 9 h a p l o t y p e s

R MP=0.125，DP=0.881.

2.2 法医学应用

应用自行设计的引物分别扩增10例尸体（死亡后12 h内）不同脏器组织（心、肝、脾、肺、肾、脑组织）mtDNA16106-16297区域。同一个体不同脏器新鲜组织和甲醛固定石蜡包埋组织mtDNA16106-16297区域扩增产物SSCP分型结果完全一致（图2）。

3 讨论

线粒体DNA遗传多态性多表现为序列多态性，其多态性程度虽远不及目前常用STR遗传标记，但在微量、降解检材DNA多态性分析方面具有特殊的意义。甲醛固定石蜡包埋组织因福尔马林固定、石蜡包埋等处理因素的影响，容易引起DNA的交联和降解，使DNA多态性分析成为法医学物证鉴定的难点［3，4］。因此，甲醛固定石蜡包埋组织等降解检材，在首选核基因组DNA多态性分析未能得到理想结果时，进行线粒体DNA多态性分析，将为案件的侦查和审理提供非常有价值的科学依据。本研究使用醋酸铵法提取甲醛固定石蜡包埋组织DNA能很好的扩增目的片段，为法医鉴定和疾病诊断与治疗提供新的思路。

SSCP技术作为一种SNPs筛查方法，它可以快速对大量样本进行筛选，而且在一定片段长度内有较高的检出率。本实验利用SSCP技术调查了北方汉族150例无关个体mtDNA（16106-16297nt）的多态性，发现9种单倍型，DP值为0.881。由于本研究的mtDNA扩增片段比较短，其中含有的碱基变异点数目较少，或者由于所选择群体样本和目的片段的不同，本研究检出的单倍型数目及个人识别率均不及艾红伟等［5］报告SSCP法检测mtDNA多态性的结果（DP=0.935 6）。但本研究的扩增产物长度较短不仅更适合降解生物性检材的mtDNA多态性分析，而且所用电泳时间较短、电泳条件相对要求不严、型别判定比较容易，更适合于基层法医物证鉴定的需要。

线粒体DNA多态性分析用于个人识别时，异质性（heteroplasmy）是必须考虑的影响因素。个体发育源于一个受精卵，理论上同一个体所有的mtDNA序列应是一致的。但实际却发现有少数同一个体的mtDNA碱基序列并不完全相同。这种同一个体mtDNA出现两种或两种以上的碱基序列的现象称为异质性。其在人体的存在表现为同一个体不同组织、同一组织不同细胞或同一细胞不同线粒体之间存在不同的mtDNA序列［6］。有文献报道［7］异质性发生率非常高，本研究对10例尸体不同脏器组织mtDNA16106-16297区域进行检测，未发现异质性。但异质性的存在应该引起我们的注意，减少由异质性引起的错误排除［8］。同时，mtDNA异质性又可作为个体的特殊标记，增加个体认定或排除的确定性。

mtDNA呈母系遗传，加之其拷贝数多、突变率高、抗腐败能力强，故mtDNA具有极高的法医学应用价值。本文利用PCR-SSCP技术对线粒体DNA进行分析，证实其有较高的鉴别能力，其简单、快速，批量检测的特点特别适合于基层单位作为常规分析技术。

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