HPLC－紫外法测定人血浆中舒芬太尼浓度

吴巧玲，王玲玲，马虹，王俊科

（中国医科大学附属第一医院麻醉科，沈阳 110001）

舒芬太尼是目前心血管手术麻醉的首选药物之一。为更好的指导临床用药，有必要对血浆中舒芬太尼浓度进行动态的监测。但由于其用量小、血药浓度低，故对检测仪器和方法的灵敏度要求高。本研究建立了一种血浆微量舒芬太尼浓度的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定方法，具有检测限低、线性好、灵敏度和精确度高的优点，适用于血药浓度监测及药代动力学的研究。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

高效液相色谱仪（Waters-600泵，Waters-2487紫外检测仪，Waters脱气机）；AR1140电子天平（奥豪斯国际贸易上海有限公司）；MVS-1旋涡混合器（北京金化德工贸有限公司）；TG16-WS离心沉淀器（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

舒芬太尼标准品、芬太尼对照品（湖北宜昌人福药业有限责任公司）；色谱纯乙腈（山东禹王）；磷酸二氢钾、氢氧化钠（沈阳试剂一厂）；正己烷、无水乙醇、磷酸（北京化工）；水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18（4.6 mm×200 mm，5μm），流动相为乙腈∶0.015 mol/L KH2PO4缓冲液（31∶69，V/V，pH=3.0）；室温下测定，流速1.0 mL/min，按内标法进行定量，监测波长200 nm，进样量 50 μL，灵敏度：0.002 AUFS。

1.2.2 舒芬太尼标准液的配制：精密称取枸橼酸舒芬太尼标准品10 mg，置于100 mL容量瓶中，定容至刻度，配制成100μg/mL的母液，依次稀释成5 000，2 000，1 000，500，200，100，50，20 ng/mL 系列浓度标准液，待用。

1.2.3 内标溶液的配制：精密称取100μg芬太尼，置于10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，即得10 μg/mL内标的储备液，用重蒸水将其稀释至500 ng/mL，4℃冷藏保存，备用。

1.2.4 血样处理：精取血浆样本200μL，加入500 ng/mL的芬太尼20μL，旋涡混合10 s，再加入100 μL的2 mol/mL NaOH，旋涡混合10 s。最后加入2 mL 正己烷－无水乙醇（19∶1，V/V），涡旋 5 min，3 500 g离心10 min，静置10 min后，移取上清液于5 mL玻璃试管中，于35℃水浴上用氮气吹干。取100μL流动相溶解残渣，涡旋混合3 min，移至离心管中，1.2×104g离心5 min，取上清液50μL进样。

1.2.5 血浆舒芬太尼标准曲线制作：精取空白血浆180μl，分别精密加入20μL舒芬太尼标准品的系列浓度，使成 500，200，100，50，20，10，5，2 ng/mL 的含药血浆，每种浓度分别配置3份，涡旋混合10 s。其余步骤同1.2.4。样品峰面积和内标峰面积比值（y）为纵坐标，样品浓度（x）为横坐标，以 1/x2为权重，作线性回归。

2 结果

2.1 色谱行为

空白血浆色谱图相应4~10 min处无峰出现，基线平稳，血中物质对舒芬太尼的分离无干扰，舒芬太尼保留时间为9.558 min，其内标芬太尼的保留时间为 4.765 min，见图 1。

2.2 舒芬太尼标准品曲线

图1 高效液相色谱图Fig.1 The high performance liquid chromatogram

分别吸取含有 500，200，100，50，20，10，5，2ng/mL舒芬太尼标准溶液的血浆各50μL进样，以样品峰面积和内标峰面积比值（Y）为纵坐标，样品浓度（X）为横坐标，作线性回归。求得舒芬太尼标准品回归方程 y=0.002 1+0.004 4x，r=0.999 6。

2.3 提取回收率

将不同血浆浓度舒芬太尼的峰面积代入血浆标准品曲线，计算得浓度值C1；代入未经处理的标准品曲线，计算得浓度值C2；C1/C2即为提取回收率。浓度为2，50，500 ng/mL血浆样品的平均提取回收率见表1。

表1 提取回收率试验结果（x±s，n=5）Tab.1 Results of the extraction recovery test（x±s，n=5）

2.4 方法回收率

根据血浆标准品曲线测得浓度与实际浓度之比即为方法回收率。浓度为2，50，500 ng/mL血浆样品的平均方法回收率见表2。

2.5 精密度

配制舒芬太尼浓度分别为2，50，500 ng/mL的血浆样品，分别于1 d内进行5次提取进样及5 d内5次提取进样，计算日内变异（relativestandard deviation，RSD）和日间变异RSD，结果见表3。

3 讨论

舒芬太尼作为一种阿片类强效麻醉性镇痛药，具有安全、快速、心血管作用稳定等优点，是目前心血管手术麻醉的首选药物之一。近年来，随着静脉麻醉和术后镇痛成为临床麻醉学发展的两个重要趋势［1，2］，使舒芬太尼的临床应用日益广泛。为更好的指导临床用药，有必要对血浆中舒芬太尼浓度进行动态的监测。但是由于其用量小、血药浓度低，故对检测仪器和方法的灵敏度要求高。目前国内外有报道利用液相色谱联合质谱法［3，4］以及气相色谱法测定血浆中舒芬太尼的浓度，但是这些方法检测费用高，不能够广泛应用。本研究建立了一种血浆微量舒芬太尼浓度的HPLC测定方法，具有操作简单、检测限低、线性好、灵敏度和精确度高的优点，且能够满足人体血浆中药物浓度的测量。

表2 方法回收率试验结果（x±s，n=5）Tab.2 Results of the method recovery test（x±s，n=5）

表3 精密度试验结果（x±s，n=5）Tab.3 Results of the precision test（x±s，n=5）

准确测定血浆中微量舒芬太尼含量的关键在于尽量避免各种物质对色谱图形的可能干扰。本研究中正己烷选用了色谱纯，能够更好的减少对基线的干扰，使基线更稳；为了提高回收率，减少正己烷对塑料物质的腐蚀，实验中应避免用塑料试管；振荡时，采用减小振荡强度，延长振荡时间的措施［5］，尽可能减少乳化现象的发生，从而有效地提高了萃取率。

综上所述，本研究建立的血浆微量舒芬太尼浓度的HPLC测定方法适用于血药浓度监测及对药代动力学的研究，为临床上进行血浆中药物浓度检测提供了良好的方法。

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