前列地尔对局灶性脑缺血大鼠p-JNK及p-c-Jun表达的影响

包翠芳，魏 嘉，梁 佳，包翠芬，闵连秋

(1锦州市中心医院，辽宁锦州121000;2辽宁医学院科学实验中心;3辽宁医学院附属第一医院)

缺血性脑病(HIE)是指局部脑组织缺血、缺氧后引发的病理过程，最终导致神经细胞凋亡或坏死，是HIE患者致残、死亡的常见原因。前列地尔有扩张血管、保护血管内皮细胞等作用，近年研究发现，该药还有神经保护作用，但其机制尚不清楚。为探讨前列地尔对局灶性脑缺血大鼠大脑皮层磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)和磷酸化c-Jun(p-c-Jun)表达的影响，分析其抗脑缺血损伤机制，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、药品及试剂 SD大鼠30只，体质量200～250 g;前列地尔脂肪乳剂(北京泰德制药公司)，尼莫地平注射液(山西亚宝药业);兔抗大鼠p-JNK、p-c-Jun单克隆抗体(SANTA CRUZ公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将30只大鼠随机分为假手术组(A组)、缺血对照组(B组)、前列地尔治疗组(C组)、阳性药物对照组(D组)，其中C组又分为前列地尔 1.25 μg/kg(C1 组)、2.50 μg/kg(C2 组)、5.00 μg/kg(C3组)三个亚组，每组5只。术前5 d至取材当日，C组腹腔注射前列地尔，D组注射尼莫地平，其余各组注射等量生理盐水。

1.2.2 HIE模型制备 采用改良线栓法制备HIE模型。自大鼠右颈总动脉剪一小口，置入直径0.20～0.26 mm的线栓，从颈总动脉分叉处计算，进线深度18～20 mm，直至大脑中动脉起始部，以完全阻断血供。模型成功的标志是大鼠即刻出现右侧霍纳征。A组除不置入线栓外，其他步骤同上。

1.2.3 神经功能缺损评分 大鼠苏醒后，参考Longa等［1］制定的5分制评分标准，对其进行神经功能缺损评分。0分示无明显神经病学症状;1分示不能完全伸展左侧前爪;2分示向左侧旋转;3分示行走时向左侧倾倒;4分示不能自动行走，意识下降。

1.2.4 免疫组化染色 各组缺血6 h后，采用4%多聚甲醛灌流固定，断头取脑，石蜡包埋，5 μm切片。石蜡切片常规脱蜡至水，行免疫组化Envision法染色。p-JNK和p-c-Jun阳性表达为细胞核内呈棕黄色。采用CIAS-1000型细胞图像分析系统检测每个视野p-JNK、p-c-Jun阳性细胞数占总细胞数的百分比。

1.2.5 统计学方法 采用 SPSS10.0统计软件，数据用±s表示，多组间比较用t检验、单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组神经功能缺损评分及大脑皮层p-JNK、p-c-Jun表达阳性率比较见表1。

表1 各组神经功能缺损评分及大脑皮层p-JNK、p-c-Jun表达阳性率比较(±s)

表1 各组神经功能缺损评分及大脑皮层p-JNK、p-c-Jun表达阳性率比较(±s)

注:与A 组比较，*P ＜0.05;与B组比较，△P ＜0.05;与C2组比较，▲P ＜0.05;与 D 组比较，#P ＜0.05

组别 n 神经功能缺损评分(分)p-JNK表达阳性率(%)p-c-Jun表达阳性率(%)A 组 5 0.00 ±0.00△▲2.30 ±1.90 8.06 ± 5.81 B 组 5 3.00 ±0.63＊▲# 24.86 ±6.46＊▲# 44.49 ±16.07＊▲#C1 组 5 2.00 ±0.63＊▲# 21.54 ±6.92＊△▲# 37.09 ±13.98＊△▲#C2 组 5 1.67±0.52＊△ 14.83±5.01＊△ 26.56±10.43＊△C3 组 5 1.17±0.75＊△ 8.35±4.03＊△▲# 16.52± 7.77＊△▲#D 组 5 1.20 ±0.42＊△ 12.83 ±4.15＊△ 22.69 ± 7.63＊△

3 讨论

近年研究表明，前列地尔除有改善血流动力学、扩血管等作用外，还能有效地减轻心肌、肝脏、脑组织等缺血缺氧状态。刘畅等［2］研究发现，前列地尔预处理对大鼠心肌损伤有早期和延迟保护作用。另外，前列地尔还可有效地抑制肝缺血后的细胞凋亡，保护移植肝，缓解长时间冷保存引起的缺血再灌注损伤，延长受体存活时间［3］;明显降低肝缺血后的ALT、AST、TNF-α，减轻肝脏缺血再灌注损伤程度［4］。田步先等研究显示，前列地尔预处理后，局灶性脑缺血大鼠的神经缺损症状明显改善，脑梗死灶明显缩小，脑水肿程度减轻，细胞凋亡数量明显减少。以上研究表明，前列地尔可有效地抑制缺血缺氧所致的细胞凋亡，但其作用机制尚不清楚。

现已明确，丝裂原活化蛋白激酶超家族成员JNK是体内主要介导细胞凋亡的因子之一，其通过活化下游效应分子p-c-Jun等引起一系列级联反应，进而诱导细胞凋亡。脑缺血损伤时JNK被激活，从而诱导细胞凋亡，导致缺血性损伤。因此，抑制JNK通路活化有望成为脑缺血损伤的治疗靶点。本研究发现，假手术组无神经功能缺损症状，偶见少量p-JNK、p-c-Jun阳性细胞;缺血对照组有明显神经功能缺损症状，其p-JNK、p-c-Jun阳性细胞明显增多，与文献报道［5］基本一致。经前列地尔处理后，p-JNK、p-c-Jun阳性细胞明显减少，提示前列地尔可能通过抑制JNK蛋白及其下游效应分子p-c-Jun活化，抑制局灶性脑缺血损伤后的神经细胞凋亡，发挥缺血性脑损伤的保护作用;还提示前列地尔在抑制神经细胞凋亡方面具有剂量—效应关系，即在一定范围内，随着药物剂量增加，其抑制神经细胞凋亡的作用明显。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20:84-91.

［2］刘畅，梅晰凡，陶贵周，等.前列地尔预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护性作用［J］.解剖科学进展，2009，15(3):286-289.

［3］王军，钱海鑫，秦磊，等.前列地尔对大鼠移植肝缺血再灌注损伤的保护作用［J］.苏州大学学报(医学版)，2010，30(1)69-71.

［4］贾红燕，李辉宇，赵浩亮.前列地尔注射液对犬肝脏缺血再灌注损伤的保护作用［J］.山西医科大学学报，2010，41(1):8-10.

［5］Gao Y，Signore AP，Yin W，et al.Neuroprotection against focal ischemic brain injury by inhibition of c-Jun Nterminal kinase and attenuation of the mitochondrial apoptosis signaling pathway［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2005，25(6):694-712.