马兜铃酸对肾小管上皮细胞氧化应激效应的作用

季文萱，黄俊彦*，孟冬梅，刘凤娟

(1青岛市中心医院，青岛266042;2青岛大学医学院附属医院，山东省代谢性疾病重点实验室，青岛266003)

马兜铃酸(AA)是马兜铃科马兜铃属植物所含的成分，含AA成分的中药曾在国内外用于治疗多种疾病，后因发现其有致突变、致肿瘤和肾毒性等而引起国内外学者广泛关注［1］。服用含AA中草药导致的肾损害［即马兜铃酸肾病(AAN)］是一种特殊的肾小管—间质损害，其主要表现为进行性肾间质纤维化;该病发展迅速，急性者数月或数年即可发展为终末期肾功能衰竭，国内发病率较高［2］，但其发病机制尚不完全清楚。研究表明，细胞凋亡与AAN发病关系密切;氧化应激可使机体处于易损状态，同时能增强致病因素的毒性作用，导致基因突变，它不仅与多种疾病的发生、发展有关，也与细胞凋亡有密切关系［3］。目前，对AAN发病机制中氧化应激作用的研究少见报道。2010～2011年，我们观察了AA对人肾小管上皮细胞(HK-2)氧化应激的效应。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要药品及试剂 AA(美国Sigma公司)，噻唑蓝试剂盒(Amresco公司)，Annexin-V试剂盒(Invitrogen公司)，丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均购自南京建成生物研究所。HK-2细胞株购自中国典型培养物保藏中心。

1.2 检测方法

1.2.1 细胞培养及分组 将HK-2细胞培养于含10%胎牛血清及1%青霉素+链霉素的DMEM，在HamsF-12培养基中传代培养，培养条件为5%CO2、37℃、湿度100%，实验前24 h更换无血清培养液。实验分两组，对照组不加任何药物;AA组在培养液中加入AA终浓度20 μg/ml。两组血清浓度一致，培养48 h后终止实验，每一实验均重复3次。

1.2.2 细胞超微结构 留取各培养瓶中的培养液，用刮匙收集细胞后分别与原培养液混合，离心弃上清;细胞沉淀后加2.5%戊二醛4℃固定4 h;然后用PBS缓冲液冲洗3次，每次10 min;1%锇酸4℃后固定2 h;PBS缓冲液冲洗3次，每次10 min;乙醇系列梯度脱水，30%、50%、70%、90%、100%的浓度每次10 min(其中100%2次)。再用Epon812环氧树脂包埋，置37℃、45℃、65℃温箱固化，每级温度24 h。用UltracutE超薄切片机半薄切片，甲苯胺蓝染色，半薄定位。UltracutE超薄切片机超薄切片，醋酸双氧铀硝酸铅染色;最后用透射电镜观察HK-2细胞的超微结构，拍照读片。在倒置显微镜下观察细胞的生长状况。

1.2.3 细胞活性 将细胞培养液置入96孔板，3×104细胞/200 μl，5%CO2、37 ℃孵育，至细胞 80%以上融合，更换无血清培养基继续培养24 h。加入AA，每组设6个复孔，5%CO2，37 ℃孵育48 h，在倒置显微镜下观察HK-2细胞活性。分别于实验终止前4 h，在每孔加入 MTT液20 μl，继续培养4 h。终止培养时，小心吸去孔内培养液，每孔加入二甲基亚砜150 μl，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪在490 nm处测量各孔的OD值。

1.2.4 HK-2细胞凋亡情况 收集细胞1×106个/ml，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清，用 PBS 重悬细胞。按照Annexin-V FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，检测各组HK-2细胞凋亡率。

1.2.5 细胞DNA含量测定 取对数生长期细胞，将细胞密度调至2×105个/ml的细胞悬液于25 ml培养瓶中培养24 h，分组处理HK-2细胞48 h;用含EDTA的胰酶消化并获取各组1×106个/ml细胞，用PBS冲洗1次，弃上清，用70%乙醇固定，4℃保存14 h以上;离心去除固定液后，用PBS洗2次，加入2 g/L核糖核酸酶A，在37℃下温育30 min;再加入50 μg/ml的非低渗碘化丙啶4℃孵育20 min，用流式细胞仪获取1×104个细胞检测DNA含量，分析G0/G1期峰前DNA含量占细胞总DNA含量的百分比，检测细胞凋亡比例。

1.2.6 氧化应激反应指标 收集两组细胞，用胰酶消化后，用PBS冲洗3遍，反复冻融，制成细胞裂解液，高速离心后取适量上清液;应用比色法检测MDA、GSH-PX活力，黄嘌呤氧化酶法检测SOD活力，分别按照试剂盒说明书检测，蛋白质定量用考马斯亮蓝法。

1.3 统计学方法 采用SSPS17.0统计软件，数据以±s表示，组间比较用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞大体及超微结构 与对照组比较，AA组培养48 h后，其脱落细胞数量明显增加，大量细胞悬浮于培养液中，贴壁细胞结构不完整;透射电镜观察显示，AA组细胞出现体积变小、染色质凝集或边集等改变，部分细胞出现崩解、坏死。

2.2 细胞活性及细胞凋亡比例 与对照组比较，AA组培养48 h后，HK-2细胞活性明显受抑制，凋亡细胞比例明显增加(见表1)。

2.3 细胞周期和细胞凋亡率 AA组细胞凋亡率为(29.39 ±0.83)%，对照组为(5.03 ±0.26)%，两组比较有统计学差异(P＜0.05)。AA组作用于HK-2细胞48 h后，G0/G1、G2/M、S期细胞比例发生变化，在G2/M期发生细胞阻滞。

2.4 两组氧化应激指标比较 见表1。

表1 两组细胞活性、细胞凋亡比例及氧化应激指标比较(±s)

表1 两组细胞活性、细胞凋亡比例及氧化应激指标比较(±s)

注:与对照组比较，△P ＜0.05

组别 细胞活性(A值)凋亡细胞比例(%)MDA(nmol/mg)GSH-PX(U)SOD(U/mg)对照组 0.83 ±0.03 5.03 ±0.26 2.19 ±0.12 72.33 ±1.77 80.01 ±1.53 AA 组 0.46±0.11△ 29.39 ±0.83△ 3.55 ±0.19△ 40.06±1.59△ 27.14±1.93△

3 讨论

AAN的确切发病机制尚不明确，以往研究多集中在肾小管上皮细胞及肾间质成纤维细胞活化、肾小管上皮细胞转分化、细胞凋亡及AA-DNA加合物等方面，对肾小管上皮细胞氧化应激效应的研究少见报道［4］。

氧化应激不仅与多种疾病的发生、发展有关，也与细胞凋亡有密切关系［5］。正常情况下，体内活性氧的产生和清除系统处于动态平衡状态;当机体处于应激状态时，体内氧化与抗氧化作用失去平衡可出现氧化应激反应。当机体处于氧化应激状态时，体内组织的细胞活性氧升高超过其清除能力，可引起脂质过氧化水平升高，导致DNA氧化损伤、蛋白质表达异常、细胞凋亡及组织损伤，造成机体损害，甚至发生肿瘤。

MDA是脂质过氧化物，可通过多不饱和脂肪酸的过氧化反应引起细胞损伤。GSH-PX是体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解酶，可特异地催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起重要作用，能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤［6］。本研究表明，不同剂量的AA可引起肾小管上皮细胞不同程度、不同类型的结构改变，使肾小管上皮细胞凋亡，导致肾小管上皮细胞大量缺失和肾小管萎缩。与对照组比较，AA组HK-2细胞MDA升高，GSH-PX、SOD活力明显下降。表明AA可降低HK-2细胞的抗氧化酶活性，造成其抗氧化能力下降，氧自由基产生增多，自由基及其产物清除障碍，导致氧化应激明显增强，造成多不饱和酸的脂质过氧化。AA诱导HK-2细胞凋亡的机制与其导致的氧化应激损伤有关，AA通过氧化应激途径能诱导HK-2细胞凋亡，氧化应激可能参与AAN的发病过程。目前，对AA本身还是在其代谢过程中，抑或代谢终产物或综合上述原因造成的氧化应激损伤尚不明了。防治氧化应激对肾脏的损伤可能是治疗AAN的新手段，并有助于进一步研究AAN的发病机制。

［1］Jha V.Herbal medicines and chronic kidney disease［J］.Nephrology(Carlton)，2010，15(suppl 2):10-17.

［2］谌贻璞，陈文.马兜铃酸肾病的研究进展［J］.肾脏病与透析肾移植杂志，2002，11(1):63-66.

［3］苏震，徐少伟，郑法雷，等.马兜铃酸对人肾小管上皮细胞转分化和凋亡作用的体外实验研究［J］.中华预防医学杂志，2002，36(5):301-304.

［4］季文萱.杨成对.刘密新.等.马兜铃酸—脱氧核糖核酸加合物的质谱分析［J］.分析化学，2008，36(7):930-934.

［5］Xie J，Guo Q.Apoptosis antagonizing transcription factor protects renal tubule cells against oxidative damage and apoptosis induced by ischemia-reperfusion［J］.J Am Soc Nephrol，2006，17(12):3336-3346.

［6］Stacchiotti A，Morandini F，Bettoni F，et al.Stress proteins and oxidative damage in a renal derived cell line exposed to inorganic mercury and lead［J］.Toxicology，2009，264(3):215-224.