紫杉醇对 TRAIL诱导胃癌 SGC7901细胞凋亡的影响

刘言厚，徐 玲，刘云鹏*，曲秀娟，汤华丽，张 晔，侯科佐

(1庄河市中心医院，辽宁庄河 116400;2中国医科大学附属第一医院)

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)能激活细胞膜表面的死亡受体 5(DR5)，从而启动内源性、外源性凋亡通路并活化下游的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，最终诱导细胞凋亡[1]。有研究报道，紫杉醇能改变 DR5的蛋白表达，从而增强前列腺癌细胞对 TRAIL的敏感性[2，3]，能否改变胃癌SGC7901细胞对 TRAIL的敏感性鲜见报道。2010年 3～10月，我们观察了紫杉醇对 TRAIL诱导的胃癌 SGC7901细胞凋亡的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 胃癌 SGC7901细胞来源来自中国科学院细胞库。重组人 TRAIL购于美国 Cytolab/Peprotech Asia公司，RPMI 1640培养基购于 Gibco公司，胎牛血清购于天津血液病研究所，甲基偶氮唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)购于 Sigma公司，核糖核酸酶A(RNase A)购于 AMRESCO公司，DR5、Actin抗体购于 Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司，ECL显色发光试剂盒购于 PIERCE公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞传代培养 将胃癌 SGC7901细胞培养在含有 10%胎牛血清、12 U/ml庆大霉素的 RPMI 1640培养液中，于 37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养，0.25%胰酶消化液消化传代。取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 细胞活力检测 采用 MTT法。将胃癌SGC7901细胞接种于 96孔板内，之后加入 0.10～50.00μg/ml的紫杉醇，或分别加入 TRAIL(100 ng/ml)和紫杉醇(7.19μg/ml)。空白对照组和阴性对照组加入等量的培养液。培养箱内培养 20 h后，每孔加入 5 mg/ml MTT 25μl，孵育 4 h后吸去上清，每孔加入 200μl二甲亚砜，振荡摇匀。用酶标仪于570 nm波长条件下测定吸光度值。按下列公式计算细胞增殖抑制率:增殖抑制率(%)=[1-(处理组平均吸光度值 -空白对照组平均吸光度值)/(阴性对照组平均吸光度值 -空白对照组平均吸光度值)]×100%。

1.2.3 细胞凋亡检测 采用流式细胞仪分析法。将胃癌 SGC7901细胞接种于 6孔板内，之后分别加入 TRAIL(100 ng/ml)和紫杉醇(7.19μg/ml)。24 h后分别收集对照组及处理组细胞，70%乙醇固定过夜 ，加入 20μg/ml RNase A，37 ℃孵育 30 min，再加入 20μg/ml PI避光孵育 15 min，用 FACScan流式细胞仪进行细胞凋亡率和细胞周期分布的检测。

1.2.4 Western blot法检测 DR5蛋白 将收集的对照组和处理组细胞裂解于 200μl含有蛋白酶抑制剂(100μg/ml苯甲基磺酰氟 ，2 μg/ml Aprotitin)的细胞组织快速裂解液中[0.1%SDS，1%Triton-100，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)，10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)]，4℃裂解 40 min，15 000 r/min离心 20 min，取上清，Lowry法进行蛋白定量。与 3倍样品缓冲液混合后，煮沸 5 min。将50μg/L的样品在 10%的 SDS-聚丙烯凝胶中进行电泳 3 h，然后转印至硝酸纤维素膜上(电压:2 mV/cm2，时间:40 min)。用 5%脱脂牛奶封闭 2 h后，按预染 Marker标记的分子量剪裁转印膜，加入 DR5、Actin抗体，4℃过夜。含吐温的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水洗 4次后加入二抗室温作用 30 min，ECL法显色，GIS凝胶图像分析系统照相并分析处理。

1.3 统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件，结果以±s表示。计量资料比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫杉醇对 TRAIL诱导胃癌 SGC7901细胞的增殖抑制作用 MTT结果显示，0.10～50.00μg/ml的紫杉醇处理胃癌 SGC7901细胞 24 h，紫杉醇以剂量依赖性方式抑制胃癌 SGC7901细胞增殖，24 h抑制细胞增殖 50%的药物浓度(IC50)是(7.19±1.13)μg/ml。100 ng/ml的 TRAIL作用胃癌 SGC7901细胞24 h，对细胞的增殖抑制率为(6.27±2.14)%;紫杉醇(7.19 μg/ml，24 h的 IC50剂量)单药作用胃癌SGC7901细胞，对细胞的增殖抑制率为(48.05±4.65)%。与单药紫杉醇相比，紫杉醇联合 TRAIL对细胞的增殖抑制作用明显增加，抑制率达到(69.24±5.33)%(P＜0.05)。

2.2 紫杉醇对 TRAIL诱导胃癌 SGC7901细胞凋亡作用 流式细胞仪显示，100 ng/ml的 TRAIL作用胃癌 SGC7901细胞 24 h，细胞凋亡率只有(3.76±1.46)%;紫杉醇(7.19μg/ml)作用胃癌 SGC7901细胞 24 h，主要诱导细胞发生 G2～M期阻滞，周期阻滞率达到(32.90±4.89)%。紫杉醇(7.19μg/ml)联合 TRAIL(100 ng/ml)作用胃癌 SGC7901细胞 24 h，发生 G2～M期阻滞的细胞减少，但凋亡细胞明显增多，细胞凋亡率达到(35.17±4.31)%(P＜0.05)。

2.3 紫杉醇对 TRAIL诱导胃癌 SGC7901细胞 DR5蛋白表达的影响 100 ng/ml的 TRAIL作用SGC7901细胞 24 h，对 DR5的蛋白表达没有影响。见图1B。7.19μg/ml紫杉醇作用于胃癌 SGC7901细胞 8 h，DR5的蛋白表达轻度上调;将作用时间延长至 24 h，DR5的蛋白表达进一步提高。见图1A。与单药紫杉醇相比，7.19μg/ml紫杉醇和 100 ng/ml TRAIL联合作用 SGC7901细胞 24 h，DR5的蛋白表达同样明显上调(P＜0.05)。见图1B。

3 讨论

TRAIL作为生物制剂能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，但研究显示 ，胃癌SGC7901细胞对TRAIL耐药，其耐药机制不明[4]。因此，提高胃癌细胞对TRAIL的敏感性十分必要。有研究显示，顺铂、表柔比星等化疗药与 TRAIL联合应用，可明显提高肿瘤细胞对 TRAIL的敏感性[5，6]，其机制尚未完全清楚。DR5作为 TRAIL的膜受体，与 TRAIL结合后能募集下游凋亡相关信号分子，从而启动凋亡通路。因此，DR5是 TRAIL启动凋亡的关键因子。

图1 紫杉醇和 TRAIL对SGC7901细胞中 DR5蛋白表达的影响

紫杉醇作为一种高活性的抗肿瘤药物，在胃癌的临床治疗中取得了很好的疗效，在恶性胶质瘤、乳腺癌和结肠癌细胞中，紫杉醇和 TRAIL有协同杀伤肿瘤细胞的效应[7～9]。Gong等报道，紫杉醇通过上调 DR5的表达，从而提高了结肠癌细胞对 TRAIL的敏感性[10]。Nguyen的研究显示，紫杉醇提高了胸部肿瘤细胞对 TRAIL的敏感性，但紫杉醇并没有改变细胞中 DR5的水平[11]。因此，在不同的肿瘤细胞中，紫杉醇对 DR5表达的影响并不一致。本研究结果显示，紫杉醇能通过上调 DR5的蛋白表达，从而增强了胃癌 SGC7901细胞对 TRAIL的敏感性。本文结果还表明，紫杉醇明显增强了 TRAIL对胃癌SGC7901细胞的增殖抑制作用。尽管紫杉醇对细胞凋亡没有明显影响，但紫杉醇使胃癌 SGC7901细胞发生了 G2～M期阻滞。紫杉醇和 TRAIL联合作用SGC7901细胞，细胞凋亡率明显提高，提示紫杉醇和TRAIL联合对胃癌 SGC7901细胞的杀伤作用增强。

总之，紫杉醇很可能通过上调 DR5蛋白的表达，从而增强 TRAIL对胃癌 SGC7901细胞的杀伤作用。紫杉醇和 TRAIL的联合应用能够逆转胃癌细胞对 TRAIL的耐药。

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