兔出血症病毒衣壳蛋白VP60与兔肝脏细胞中相互作用蛋白的初步筛选

穆亚芳，刘家森，郭东春，李茂中，原冬伟，姜 骞，林 欢，曲连东

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物研究室，黑龙江 哈尔滨 150001)

兔病毒性出血症(Rabbit viral hemorrhagic disease，RHD)是由RHD病毒(RHDV)引起兔的一种急性、败血性、高度致死性传染病。RHDV属于嵌杯病毒科兔病毒属，为单股正链RNA病毒，其基因组中含有两个开放阅读框(ORF)[1]。VP60蛋白由ORF1编码，为RHDV的主要结构蛋白，在诱导抗病毒感染免疫反应中起重要作用[2]。

RHDV主要在肝脏中增殖，导致肝坏死和实质脏器发生水肿、淤血和出血等病理变化[3-4]。兔肝脏细胞中存在能够与病毒相互作用的蛋白，并且在介导病毒侵染肝细胞过程中起到重要作用。因此，从兔肝文库中筛选与RHDV衣壳蛋白VP60相互作用的细胞蛋白具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 菌株、细胞系及实验动物 DH5α、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存；聚苯乙烯(PS)流式细胞管购自BD公司(简称PS管)；纯化可溶性VP60蛋白为本实验室制备[5]；3月龄普通级新西兰大白兔由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 SfiⅠ酶、T4 DNA连接酶、Ex Taq聚合酶、DNA Marker等均购自TaKaRa公司；组织总RNA抽提试剂盒购自QIAGEN公司；cDNA文库构建及筛选试剂盒(MatchmakerTMLibrary Construction&Screening Kits)、文库扩增 PCR试剂盒(Advantage®2PCR Enzyme System)购自 Clontech公司；组织/细胞DNA小量抽提试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司；质粒小量提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司；FuGENE®HD Transfection Reagent购自Roche公司。

1.3 引物合成 试验中所用引物根据文库扩增PCR试剂盒提供序列进行合成(表1)。引物的合成及测序由Invitrogen公司完成。

1.4 真核表达文库的构建 按照组织总RNA抽提试剂盒操作说明书提取3月龄兔肝组织总RNA，并构建兔肝脏的pEXP-lib真核表达初级文库。初级文库按1∶100稀释，扩大培养后抽提质粒即为真核表达文库。

1.5 文库质量的鉴定 从LB平板上随机挑选21个菌落，PCR鉴定文库插入片段大小。反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 30 s、55℃30 s、72℃ 90 s，30个循环；72℃10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 SP2/0细胞嘌呤霉素最小致死浓度的测定 将嘌呤霉素按 1 μg/mL、2 μg/mL、3 μg/mL、4 μg/mL、5 μg/mL 和 6 μg/mL 6个浓度接种 90%的 SP2/0单层细胞，每个浓度设4个重复，持续培养72 h，选择能够使SP2/0细胞全部死亡的最低浓度为最佳致死浓度。

1.7 兔肝脏cDNA重组质粒文库转染SP2/0细胞试验 按照FuGENE®HD说明书操作步骤，将兔肝脏cDNA文库质粒转染SP2/0细胞，于转染72 h时进行细胞筛选。

1.8 细胞筛选 以1 μg纯化的VP60蛋白包被PS管，1%BSA于37℃封闭2 h后加入2 mL转染72 h的细胞悬液，37℃水平旋转孵育2 h后，1000 r/min室温离心5 min，收集细胞。嘌呤霉素筛选培养72 h后，收集细胞进行第2轮、第3轮筛选，用500 ng纯化的VP60蛋白包被PS管，其余操作同前。同时设立正常SP2/0细胞对照。

1.9 重组质粒特异表达序列的鉴定 收集第3轮筛选的细胞，提取重组质粒，转化E.coliDH5α感受态细胞，抽提重组质粒，PCR鉴定后由Invitrogen公司测序，将测序结果去掉载体序列后录入NCBI网站进行Blastn比对。

2 结 果

2.1 文库质量的鉴定 随机挑选21个菌落进行PCR鉴定，产物经琼脂糖凝胶电泳分析(图1)，表明插入片段分布在0.3kb～2.0kb之间，重组率约为86%。

2.2 SP2/0细胞的嘌呤霉素最小致死浓度的测定SP2/0细胞经不同浓度嘌呤霉素培养72 h后观察生长存活情况，重复试验显示，3 μg/mL的嘌呤霉素为SP2/0细胞72 h的最小致死量。因此，在真核重组质粒转染的细胞筛选试验中，选择3 μg/mL的嘌呤霉素。

2.3 VP60蛋白筛选的SP2/0阳性细胞中重组表达质粒的PCR鉴定 从筛选的SP2/0阳性细胞中提取重组质粒转化E.coli后，在LB平板上挑取菌落，提取重组质粒，PCR鉴定结果显示扩增片段单一，大小分布在0.3 kb～2.0 kb之间，与兔肝文库片段大小一致；而阴性对照无条带。

2.4 阳性SP2/0细胞中重组表达质粒的序列分析去除序列相同的克隆，测序结果表明50个克隆中，有26个EST序列与一些兔的功能基因有较高同源性，包括代谢途径中的各种酶类13个、免疫信号通路中的各种受体蛋白5个以及其他细胞膜蛋白等(表2)；11个EST序列与其他种属哺乳动物的功能基因有较高的同源性；另外，有13个为未知基因。其中一个EST经Blastn分析表明，其核苷酸序列与已报道的兔α1抗蛋白酶s1(Alpha-1-antiproteinase S-1 precursor)的末端序列具有显著的同源性，分值达到848，预测的氨基酸序列与兔α1抗蛋白酶s1的末端序列具有显著的同源性，分值达到245。另一个EST经Blastn分析显示，其核苷酸序列与已报道的兔铁蛋白重链1(Ferritin H-chain)的3'端序列具有显著的同源性，分值达到419，预测的氨基酸序列与兔铁蛋白重链1的3'端序列具有显著的同源性，分值达到 79.5(表 2)。

表2 与兔功能基因同源的EST序列Table 2 The EST sequences highly homologized with Oryctolagus cuniculus in GenBank

3 讨论

目前，构建cDNA文库是功能基因组学研究的基本手段之一，主要方法有Oligo-capping法、CAPTURE法、SMART法、Cap-Select法、Cap-jumping法以及Cap-trapper法等，其中SMART法因其可以最大限度地获得全长cDNA而得到广泛应用[6-8]。本实验以真核表达载体pEXP-lib为基础，利用SMART技术构建了兔肝细胞的真核表达文库，文库插入片段大小范围为0.3 kb～2.0 kb。表达性克隆筛选系统是筛选功能性蛋白的一种有力方法，本实验利用质粒形式的表达性克隆从兔肝细胞文库中筛选到与VP60蛋白相互作用的蛋白。实验选用的载体pEXP-lib由文库构建及筛选试剂盒提供，能够在真核细胞内进行蛋白表达。SP2/0细胞是一种半贴壁细胞，在短时间内以及旋转孵育的方式下，细胞不贴壁，只有表达了与VP60紧密结合的细胞表面蛋白的细胞才会贴壁[9]，所以我们选用该细胞进行筛选。根据载体的抗生素表型，试验确定了嘌啉霉素对SP2/0细胞的最小致死浓度为3 μg/mL。在表达性克隆筛选系统中，重复筛选是获得单细胞克隆的关键[10-11]。本实验利用包被VP60蛋白的PS管，经3次筛选从文库中选取与VP60蛋白相互作用的蛋白，筛选结果表明50个重组质粒中插入片段的EST序列，有26个EST序列与兔功能基因有较高的同源性。本实验的筛选结果与本研究的酵母双杂交结果存在交叉性(数据另行发表)，表明通过该实验方法筛选功能性蛋白的可行性。实验中获得的26个EST序列与日本大耳白兔功能基因均具有较高的同源性，但对于其在RHDV感染过程中的作用，还需进一步鉴定。

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