西宁市售动物性食品中肠出血型大肠杆菌O157∶H7的检测

李增魁，马 兰，种伟雄

（青海大学农牧学院，青海 西宁 810016）

食源性病源微生物品安全的重要因素，其中大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠埃希氏菌（enterohemorrhagic escherichia coli，EHEC） 的一个主要菌型，是近年来新发现的严重危害人类生命健康的一种肠道病原性微生物，也是近年来在食品卫生及肠道感染领域中最重要的研究进展之一。肠出血性大肠杆菌O157:H7主要通过食物传播，牛、羊、猪和鸡等家畜家禽是其主要贮存宿主。感染此菌可使人患腹泻、出血性结肠炎（HC），也可引发溶血性尿毒综合症（HUS）及血检形成性血小板减少性紫癜（TTP）等严重并发症等，甚至死亡。

E.coli O157:H7于1983年被首次分离[1]，属于肠杆菌科埃希氏菌属。革兰氏染色阴性，无芽孢，有鞭毛，动力试验呈阳性。1996年在日本发生的EHEC O157:H7的暴发流行，引起出血性腹泻，先后波及30多个都、府、县，感染近万人，并造成12人死亡，引起了全世界的关注[2]。以前O157:H7大肠杆菌仅为世界发达国家引起食物中毒的暴发流行，与畜食类制品有关[3]。近来国内本菌流行尚有抬头之势[4-6]。据报道市场零售肉类污染率，牛肉为3.7%，猪肉1.5%，羊肉2.0%，禽肉1.5%，认为这都与屠宰过程中污染有关[7]。2010年，我们按传统方法对西宁部分市场的动物性食品进行了大肠杆菌O157:H7选择培养，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试样来源

羊肉及牛肉各20份均采自西宁市乐家湾屠宰场，猪肉、鸡肠、鸡蛋各20份、卤肉10份采自莫家街、小桥、商业巷等市场。

1.1.2 菌株

大肠杆菌Escherichia coli O157:H7菌株86-24购于广东省微生物菌种保藏中心；试验菌株均从试样中分离。

1.1.3 实验试剂

头孢克肟（上海海虹实业）、亚碲酸钾（华北化学试剂开发中心）、山梨醇（北京奥博星生物技术有限责任公司）、新生霉素（青岛高科园海博生物技术有限公司）、月桂基硫酸钠（华北地区特种化学试剂开发中心）、三号胆盐（北京奥博星生物技术有限责任公司）。

1.1.4 实验仪器

电热恒温培养箱（苏州宏拓电子有限公司）、移液枪（上海科华实验系统有限公司）、暗箱式紫外线透射分析仪 MODEL Fs-312（上海复生生物工程研究所）、回旋式气浴恒温振荡器SHZ-82（金坛市科技仪器有限公司）。

1.1.5 培养基

1.1.5.1 蛋白胨水配方 蛋白胨1 g，氯化钠0.5 g，水加至100mL pH调至7.8；胰蛋白胨20g，3号胆盐1.5 g，乳糖 5 g，磷酸二氢钾 1.5 g，磷酸氢二钾 4 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000mL。

以上成分混合、加热、融化，调节pH6.9±0.2，高压灭菌，冷至50℃左右，加新生霉素，新生霉素终浓度为 20 μ g/mL，倾倒平板即可。

1.1.5.2 改良山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）培养基配方 蛋白胨7 g；眎蛋白胨3 g；猪胆盐5 g；山梨醇10g；氯化钠5 g；琼脂18 g；0.5%中性红水溶液5mL；0.01%结晶紫水溶液10mL；亚碲酸钾2.5 mg；头孢克肟0.05 g；蒸馏水1000mL，pH7.2。

除山梨醇、指示剂、抑菌剂外，115℃灭菌20min至50℃，加入山梨醇，灭菌的0.01%结晶紫水溶液、0.5%中性红水溶液，过滤除菌的1%亚碲酸钾250μL和50g/L头孢克肟1mL。

1.1.5.3 MUG-LST肉汤培养基配方 胰蛋白胨20g，氯化钠5 g，乳糖5 g，磷酸二氢钾2.75 g，磷酸氢二钾2.75 g，月桂基硫酸钠0.1 g，蒸馏水1000mL。

分装到有倒立发酵管的试管中，每管10mL，pH6.8±0.2，121℃灭菌15min。加MUG终浓度0.1g/L。

1.1.5.4 NFA培养基配方 酪蛋白胨20g，肉浸膏2 g，酵母浸膏1 g，山梨醇10g，枸橼酸铁铵0.5 g，硫代硫酸钠2 g，去氧胆酸钠1.12 g，溴酚蓝0.025 g，琼脂 13 g，蒸馏水 1000mL。pH7.4，121 ℃灭菌 15min。

1.1.5.5 营养平板和肉汤 按常规配方配制。

1.2 实验方法

1.2.1 E.coli O157:H7的显微形态

通过革兰氏染色和鞭毛染色来观察其显微形态，确定其为革兰氏阴性菌并有鞭毛存在。

1.2.2 E.coli O157∶H7的增菌培养

1.2.2.1 无菌称取25 g试样于225mL mEC增菌液，（41±1）℃培养 18～24 h。

1.2.2.2 接种于TC-SMAC上，（36±1）℃培养18～24 h，观察菌落形态，若菌落扁平、透明或半透明，边缘光滑、呈淡褐色中心直径越2mm，视为可疑菌落。

1.2.2.3 挑取5～10个可疑菌落接种于MUG-LST，（36±1）℃培养18～24 h。观察MUG-LST培养结果，若出现产气且无荧光者判为MUG阴性培养物。

1.2.2.4 可疑菌接至NFA培养基（36±1）℃培养18～24 h，观察菌落形态。

1.2.2.5 同时转接普通营养琼脂（36±1）℃培养18～24 h。

1.2.3 E.coli O157:H7的生理生化特性 根据E.coli O157:H7具有大肠杆菌的通性，如发酵葡萄糖并产酸产气等，同时还具有自身的特性，如不发酵山梨醇或迟缓发酵山梨醇设计了E.coli O157:H7的生理生化实验，其中检测项目包括葡萄糖、乳糖、木糖、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、甘露醇的发酵实验、柠檬酸盐利用实验、过氧化氢酶实验、苯丙氨酸脱氨实验、赖氨酸与精氨酸脱羧酶实验、硝酸盐还原实验以及精氨酸双水解酶实验。

2 结果

2.1 检出率 对西宁市售的动物性食品羊肉20份、牛肉20份、猪肉20份、鸡肉20份、牛奶20份、卤肉10份共110份进行了检验，从羊肉中检出大肠杆菌O157:H71株，占0.9%。

表1 6类食品中EHEC O157:H7的检出情况

2.2 分离菌株生物学性状

2.2.1 形态 分离菌株均为革兰阴性无芽胞杆菌，在营养肉汤和EC肉汤中生长良好，在TC-SMAC平板上37℃培养24 h后的菌落形态呈菌落扁平、透明或半透明，边缘光滑，呈淡褐色中心；普通大肠杆菌呈粉红色菌落。纯培养物接种NFA培养基平板，37℃培养24 h观察，20min在暗室中长波紫外灯下，为绿色菌落。普通大肠杆菌呈黄色菌落，且产生有很强的电蓝色荧光。在MUG-LST肉汤培养基中，产气，无荧光。

2.2.2 生化反应特性 均符合大肠杆菌特征，能分解乳糖产酸产气，系统生化见表2。

由表2可见:分离到的菌株发酵葡萄糖、乳糖产酸产气，木糖、棉子糖、甘露醇呈阳性；迟缓发酵山梨醇；赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶实验、过氧化氢酶实验呈阳性，硝酸盐还原实验、侧金盏花醇、苯丙氨酸脱氨实验、硫化氢均为阴性，这些结果都符合典型的E.coli O157:H7的生理生化特性[8]，并可与肠杆菌科绝大部分菌区分[9]；致贺氏菌属、耶尔森氏菌属和爱德华氏菌属不发酵葡萄糖；柠檬酸细菌属不与赖氨酸反应；沙雷铁氏菌属、克雷伯氏菌属和变形菌属不与精氨酸反应。以上这些菌属都可通过上述生理生化反应来加以区分（不包括变异株）。

表2 试验菌株与参考菌株的生化特性比较

3 分析与讨论

3.1 新病原性微生物和重新抬头的病原微生物是当前医学界面临的一个新的课题，对人类健康构成重大威胁。肠出血性大肠杆菌O157:H7就是其中之一[10]。以前E.coli O157:H7仅为世界发达国家引起食物中毒的暴发流行[3]，近年来国内对本菌多有检测[4-6]。目前有人从蔬菜及熟肉制品中分离出O157:H7肠出血性大肠杆菌，从而证实了EHEC在我国食品中存在感染[11]。本次调查从市售羊肉中分离到了疑似E.coli O157:H7，检出率为0.9%，猪肉、牛肉、鸡蛋和卤肉中未检出。这提示我市动物性食品中存在食源性致病菌污染，应予以重视。也证明了绵羊确是O157:H7贮存宿主。猪肉、牛肉、鸡蛋、熟肉虽未检出致病菌，可能与季节气温较低或取样品数量等有关，加强食品卫生管理，控制可能出现的传染源，切断传播途径，提高群众防范意识，是杜绝O157:H7食物中毒暴发流行的关键所在。

3.2 本次分离的菌株经鉴定，菌体形态典型，培养及生化特性均符合于大肠杆菌的定义，并具有不发酵或迟缓发酵山梨醇的特性，同时在O157:H7的选择性培养基TC-SMAC平皿上生长出典型的扁平、透明或半透明，边缘光滑，呈淡褐色中心的菌落。NFA培养基平板上在暗室中长波紫外灯下，为绿色菌落。March等[12]用TC-SMAC平皿对O157:H7进行检测，其检测的灵敏度为100%，但是特异性只有85%，准确率只有86%。为了提高检测效率，在SMAC培养基中加入鼠李糖（rharose）和头孢克肟（cefixime）改进，成为CT-SMAC培养基[13]，提高了分离的准确性；FARMER等[14]利用O157:H7有H7抗原，而其他大肠杆菌只有10%的具有H7抗原的特性，设计了H7抗血清—山梨醇发酵培养基，其假阳性率小于1%。但是由于O157:H7与其他一些病原菌有共同的特性，用单一的方法检测，无论如何都达不到满意的效果，对此我国[15]以及FDA[16]在制定检测标准时加了生理生化特性验证和血清（免疫）学验证，以保证检测的准确性。

3.3 本次分离的菌株在MUG-LST肉汤培养基中，产气，无荧光。李景学等[17]认为96%的大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶，故水解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），产生荧光，而O157:H7则为阴性反应。

3.4 Krishman等[18]分别报道的24株和37株O157:H7的生化结果，其山梨醇均为阴性，而赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、棉子糖和卫矛醇均为阳性，故以这5种生化特性作为O157:H7与普通大肠杆菌的鉴别要点。但叶青[19]分离的O157:H7中2株为山梨醇阳性、棉子糖阳性，1株卫矛醇阳性。故说明有的菌株发生变异，其部分生化反应也不完全一样。Krishman证实，山梨醇、MUG阴性、棉子糖阳性仅发生于大肠杆菌O157:H7血清型，对检测该菌非常有效。本次分离到的菌株发酵葡萄糖、乳糖产酸产气，木糖、棉子糖呈阳性；迟缓发酵山梨醇；赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶实验、过氧化氢酶实验呈阳性，硝酸盐还原实验、侧金盏花醇、苯丙氨酸脱氨实验、硫化氢均为阴性。此结果与国内学者的结果一致。

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