麻鸡源性粪肠球菌的分离及初步鉴定

李金平，陈 杰，庄青叶

（中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032）

粪肠球菌（Enterococcus faecalis）属于链球菌科（Strep tococcaceae）肠球菌属（Enterococcus），为兼性厌氧的革兰阳性球菌，自然界和动物粪便中大量存在。其为机会感染菌，在人医上已成为院内感染的第二大病原，在动物领域，对其研究较少。乌鲁木齐地区的麻鸡发生了一种疾病，剖检可见，肝肿大严重，边缘有坏死，脾肿大，肾肿大严重，有肿瘤结节，腺胃厚硬，乳头环状出血，肠道水肿出血。试验从麻鸡体内分离到一株可疑菌，并进行了初步鉴定。

1 材料与方法

1.1 病料来源

病料来自乌鲁木齐市北站周围养殖场的麻鸡；未知细菌平板培养物来自乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心。

1.2 粪肠球菌的分离

无菌取病死羊的脑、肝、肠系膜淋巴结、脾等组织，接种于鲜血琼脂LB平板，37℃厌氧培养48 h，观察生长情况及菌落特征。取单个疑似菌落继续在琼脂培养基上纯化培养，对纯培养菌落进行革兰染色，镜检。

1.3 菌株16 S rDNA基因序列鉴定

参照参考文献[1]设计细菌16 S rRNA基因片段PCR扩增通用引物，序列为上游引物5'-ATAACAATTTCACACAGG-3'下游引物5'-AGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。按照TaKaRaminiBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0（TaKaRa Code:DV810A）提取纯培养细菌的基因组，以纯培养细菌染色体DNA为模板，扩增其16 S rRNA基因片段。PCR反应条件为94℃预变性4min；94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。将上述扩增的目的片段用DNA片段回收纯化试剂盒回收（按试剂盒说明书操作），并与pGEM-T easy载体连接过夜；转化E.coliDH5α感受态细胞；将转化的受体菌涂布在预先用 100mmol/L IPTG 20μL、20 mg/mL X-gal 100μL涂布、Amp终浓度为10 μ g/mL的LB平板上，37℃培养过夜。挑取白色菌落接种于含Amp（10 μ g/mL）的LB液体培养基中，37℃、170 r/min恒温振荡培养8～12 h；提取质粒，阳性质粒送上海工程技术服务有限公司测序。将测得的16 S rRNA基因片段，与GenBank中发表的粪肠球菌16 S rRNA基因进行基因序列同源性分析。

2 结果

2.1 菌株形态

菌株在血琼脂培养基厌氧培养2 d后，菌落呈灰白色、不透明、表面光滑，直径0.5～1mm。在光学显微镜下观察，菌体为红色，革兰阳性球菌，呈单个、成对或短链状排列。

2.2 分离菌株16 S rRNA基因的PCR扩增结果

从提取的基因组DNA模板中扩增得到16 S rRNA基因片段。1.0%的琼脂糖凝胶电泳证明获得了与预期片段大小（500 bp）相符的、清晰的，单一条带（图 1）。

2.3 分离菌株16 S rRNA基因序列测序结果

将大小约为500 bp的16 S rRNA基因序列测序结果用Blast进行序列比对，结果表明:分离株16 S rRNA基因与GenBank中发表的粪肠球菌的16 S rRNA基因序列同源性达到99.0%，确定分离菌株为粪肠球菌。

3 讨论

粪肠球菌广泛存在于土壤、植物、乳制品中，为人、犬、禽、猪、马等动物胃肠道正常菌群之一。近年在临床上由粪肠球菌引起的感染有逐年上升趋势，已成为呼吸系统、泌尿系统、伤口感染、院内感染的常见菌，并对多种抗菌药物耐药[2-3]。国内对该菌的研究主要集中在其致病性及防治方法上，而国外对其抗药性在基因水平上进行了大量的研究。目前，粪肠球菌在国内外都已经被批准作为微生态制剂菌种使用。

粪肠球菌为人兽共患条件致病菌，应引起实验动物从业人员的高度重视。开展肠球菌感染的研究，可能会使人们提高对肠球菌感染认识的警惕性。粪肠球菌为机会感染菌，其感染的原因可能与麻鸡的体质、环境温度、卫生以及粪肠球菌的耐药性等有关，具体原因有待于调查。动物品质和环境因素是不可忽视的原因，应加强对实验动物和环境设施的管理。

[1]赵贵明.食品微生物实验室工作指南[M].北京:中国标准出版社，2005.

[2]刘凤强，姬生瑞.检出160株肠球菌的分布及耐药性分析[J].中国热带医学，2005，5（9）:1879.

[3]胡龙华，贾坤茹，陈东红，等.临床分离的肠球菌株耐药性变迁分析[J].中华医院感染学杂志，2004，14（8）:944-946.