山羊干酪性淋巴结炎病原的分离和鉴定

韦志锋 ，李常挺 ，陶 立 ，李 军 ，林忠捷 ，陈泽祥 ，杨 威

（1.广西兽医研究所，广西 南宁 530001；2.广西隆安县动物疫病预防控制中心，广西 隆安 532700；3.广西隆安县都结乡水产畜牧兽医站，广西 隆安 532712）

2010年9月我所接到一起以皮下浅表淋巴结肿大，后期肿大淋巴结呈脓性干酪样坏死的病例报告。该病例虽然病羊全身症状不明显，死亡率低，但发病率较高，很难彻底根除。由于病羊经常不断，生长缓慢、消瘦，给农户造成很大的经济损失。为了查明病因，我们进行了流行病学的跟踪调查，无菌采集干酪样脓汁病料作实验室病原的分离鉴定，经对病原分离培养、生化试验、动物致病性试验和PCR检测鉴定该病病原为伪结核棒状杆菌，并根据药敏试验的结果对病羊进行治疗，提出了综合防治措施。

1 流行病学和临床症状

该养殖场位于隆安县都结乡，现有存栏山羊120多只，以饲养本地黑山羊和隆林山羊的杂交后代为主，也引进有少量波尔和努比亚等外来品种。据畜主反映，半年多前开始发病，发病主要集中在春夏季，其他季节也陆续有发生。以母羊、大羊发病为主，外来品种的山羊发病较多，小羊（约2～3月龄）也有零星发生。累计发病多达40余只，发病率约为30%左右。现场观察，主要临床症状是:在耳朵两侧、颌下、颊部、肩前和乳房附近等淋巴结密集区域有鸽蛋至乒乓球大小的圆形或椭圆形的肿胀，起初手感较硬，在1个月左右、快则10～20天开始化脓，触之有波动感；继而脓肿破溃，流出黄白色或淡黄绿色浓稠如牙膏状的脓汁，经现场测温，病羊体温不高，在面部有脓肿时同侧出现轻微流涕或稍有眼屎现象；无拉稀、咳嗽；脓块开裂时采食略有减少；病羊有轻微消瘦。

2 实验室检查

2.1 材料

2.1.1 病料 来自山羊皮下浅表淋巴结脓肿脓汁。

2.1.2 试剂仪器和动物 马丁汤、10%犊牛血清的马丁汤、麦康凯、马丁琼脂和兔血琼脂平板均为广西兽医研究所细菌研究室配制，微量生化管和各种药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。PCR Taq Mix、DNA Marker 3购自广东东盛生物科技有限公司。PCR仪购自日本TaKaRa公司；凝胶成像系统购自美国Alpha Inotech公司。试验用小白鼠购自广西中医学院实验动物中心。

2.2 方法

2.2.1 脓肿脓汁涂片，革兰氏染色后于光学显微镜下镜检。

2.2.2 病原的分离培养 将脓肿脓汁分别接种马丁汤、10%犊牛血清的马丁汤、麦康凯、马丁琼脂和鲜血琼脂平板，37℃培养24～48 h，观察菌落的形态。并取单个菌落染色镜检和作纯化培养。

2.2.3 病原生化特性试验 纯化菌接种各种微量生化管，经37℃24～48 h培养观察结果。

2.2.4 致病性试验 取纯化菌的24 h 10%犊牛血清马丁汤培养液进行了小白鼠致病性试验，试验组分皮下和腹腔接种2组，每组4只小鼠，每只均接种0.3mL菌悬液，对照组3只小白鼠腹腔接种等量的10%犊牛血清马丁汤作对照，观察结果。

2.2.5 PCR鉴定 用细菌基因组DNA提取试剂盒抽提病原菌纯培养物的DNA，按Morenol等（2002）方法[1]进行16S rRNA基因的PCR鉴定。

2.2.6 药敏试验 将纯化的病原菌先在10%犊牛血清马丁汤中培养18～24小时，取此时的菌悬液0.2mL均匀涂布在10%犊牛血清马丁琼脂平板，涂布好的每个琼脂平板静置片刻，再将药敏试纸片放置在平板划定的区域，37℃倒置培养24 h后，测量抑菌圈（含纸片）的大小，每种药物作3次重复取平均值为抑菌圈直径。判断标准:抑菌圈直径6mm以下为不敏感，7～9mm为低敏，10～15mm为中敏，16mm以上为高敏。

3 结果

3.1 脓汁涂片染色镜检，发现有少量革兰氏阳性的球杆菌，无荚膜和芽胞，多呈散在或成丛状排列，抗酸染色阴性。

3.2 病原生长特性和形态观察 结果发现，分离菌在马丁汤和马丁琼脂平板上生长缓慢，48 h后才开始见菌生长，在麦康凯琼脂上不生长，但在鲜血琼脂或犊牛血清琼脂上生长良好，接种24 h出现针尖大小的菌落，48 h后见有直径在1mm大小，灰白色、不透明的菌落，菌落干燥、中央突起、边缘不整齐，在鲜血琼脂平板上有β型溶血环。菌落在培养基上附着不牢，铂金耳挑出时易破碎或移动。取单个菌落在含10%犊牛血清的马丁汤中培养，24 h后血清肉汤明显变混浊，48 h后管底出现絮状沉淀，液面有白色的菌膜。单个菌落培养物染色镜检为多形态革兰氏阳性的球杆菌。

3.3 病原生化试验 分离菌株经纯化分别接种各微量生化管，在37℃培养48 h后观察，结果见表1。其生化特性与《伯杰细菌鉴定手册》[2]中的伪结核棒状杆菌的生化特性相符合。

表1 分离细菌的生化特性试验结果

3.4 致病性试验 结果发现经皮下接种的小鼠均在3～4天全部死亡，剖解可见接种部位化脓，周边皮下组织呈胶样浸润，肝脏表面有大头针大小的化脓灶；腹腔接种的小鼠均在2～3天全部死亡，剖解见肝脏、脾脏有大小不等的脓肿。取肝脏、脾脏涂片镜检可见革兰氏阳性的球杆菌，并从皮下脓汁、肝脏、脾脏中回收到接种菌。对照小鼠在试验期间均无异常表现。

3.5 病原的PCR鉴定 用细菌16S rRNA基因通用引物对病原菌纯培养物提取的DNA模板进行PCR扩增，获得约1200 bp的目的片段（图1）。将PCR产物送测序，测序结果与GenBank上登录的伪结核棒状杆菌（登录号D38578和CP002097）的核苷酸序列同源性100%，测序结果表明病原菌纯培养物为伪结核棒状杆菌。

3.6 药敏试验结果 该菌对丁胺卡那、环丙沙星、头孢噻肟、恩诺沙星、头孢曲松钠、林可霉素、红霉素等高敏；对复方新诺明、卡拉霉素、利福平、四环素、链霉素等中敏；对氯霉素、庆大霉素低敏；对青霉素G、头孢拉定不敏感。

4 小结和讨论

4.1 根据山羊发病经过，临床症状、病理变化和病原经培养特性、生化试验、致病性试验和PCR鉴定，确诊本病为伪结核棒状杆菌引起的山羊干酪性淋巴结炎，证实其病原为伪结核棒状杆菌。2010年10月郑敏等[3]首次报道了从广西崇左市大新黑山羊病例中分离到伪结核棒状杆菌，此次分离菌株的性状与其基本一致，也与贵州、陕西等地分离的菌株一致[4-5]。

4.2 对全群羊逐只进行体表检查，隔离病羊。同时全面清扫羊栏，对羊舍、场地、用具等用消毒威1:300倍稀释喷洒消毒，将羊粪清理并堆积自然发酵。根据药敏试验的结果，对病羊体表成熟脓肿用消毒好的刀片切开，挤出排干脓汁，后用灭菌生理盐水彻底冲洗干净，再用磺胺结晶粉涂于患处，并根据药敏试验的结果，肌注环丙沙星3天，未发病羊也可减半药量肌注3天作为预防。经上述处理后病情很快得到控制，未见新的病例发生。

4.3 山羊干酪性淋巴结炎（caseous lymphadenitis in goat）也称山羊伪结核病，是由伪结核棒状杆菌引起的一种人畜共患的慢性传染病[6]。该病不仅引起以皮下浅表淋巴结肿大，后期呈脓性干酪样坏死的病变，最严重的病例可在内脏器官肺、肝、脾和子宫角发生大小不等的结节，内含淡黄色干酪样物质。由于病灶结节有一层致密的纤维性肉芽组织包裹，治疗药物往往难以渗入其内，此外，伪结核棒状杆菌可寄生于细胞内，也使得一些药物难以发挥作用，因此被世界公认为难以防治的传染病之一[7-8]，国内目前尚无有效的菌苗用于预防，因此消除该病重在预防，主要措施如下。一不从疫区引种，非要引种时一定要严格检疫。二定期消毒羊场，搞好环境卫生，特别对病羊脓汁污染的场所及饲草，应进行彻底的消毒和清除。及时清理羊粪并进行生物发酵处理。三定期检查羊群，发现体表淋巴结肿大、化脓者，应隔离治疗。四注意保护羊只皮肤免遭损伤，特别是打耳标、打针或去势手术等，注意器械的消毒和伤口的处理，防止被该菌感染。五由于鼠类是它们的保存宿主，而且可通过蚊和鼠蚤的叮咬而传播，因此要加强羊场周边的灭鼠和灭蚊。六要加强饲养管理，确保饲料质量和饮水清洁卫生。圈养山羊要注意补喂精料、多维和各种微量元素，保持营养平衡，增强羊的体质和自身抗病能力。

[1]Morenol C，Romerol J，Espejo R T.Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J].Microbiology，2002，148:1233-1239.

[2]R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组，译.8版.北京:科学出版社，1984:382-389，833-844.

[3]郑敏，胡杰，欧绍毅，等.广西黑山羊伪结核棒状杆菌的分离与鉴定[J].广西农业科学，2010，41（10）:1128-1130.

[4]王璇，潘淑惠，万晴姣，等.贵州山羊伪结核棒状杆菌的生化鉴定[J].上海畜牧兽医通讯，2006（5）:33.

[5]王韦华，张彦明，邢福珊，等.羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定及 ELISA 检测方法建立[J].中国兽医学报，2005，25（1）:34-36.

[6]Batcy R G.Aspects of pathogenesis in a mouse model of infection by Corynebacterium pseudotuberculosis[J].Aust J Exp Biol Med Sei，1986，64（3）:237-249.

[7]赵宏坤，范伟兴，胡敬东，等.羊伪结核病研究进展[J].中国预防兽医学报，2000，22（3）:236-237.

[8]杨雪红，郭雪洁，马宁君，等.羊干酪性淋巴结炎研究进展[J].上海畜牧兽医通讯，2008（1）:2-3.