携带小反刍兽疫病毒H基因的重组山羊痘病毒构建和鉴定

南文金 ，王清华 ，赵永刚 ，吴晓东 ，包静月 ，王志亮

（1.中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病诊断中心，山东青岛 266032；2.韶关学院英东动物疫病研究所，广东韶关 512005）

小反刍兽疫（Peste des Petits Ruminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants virus，PPRV）引起的小反刍动物（特别是山羊和绵羊）的烈性，接触性传染病。具有极高的发病率和死亡率，主要侵害淋巴组织及消化道上皮组织，病症包括高热、大量的眼鼻分泌物、流涎、坏死性口炎、胃肠炎及支气管肺炎，解剖时在大肠可见特异性斑马条痕[1-2]。

PPRV是副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbitlivirus）成员[2]。该病最早流行于非洲赤道到撒哈拉地区[3]，近年来在南亚地区广泛流行并不断蔓延。虽然我国把它作为重要的外来动物疫病进行了预防，但2007年PPR还是在我国与印度接壤的西藏阿里地区暴发，造成了一定的经济损失[4]。

早期该病主要用同属的牛瘟病毒疫苗预防[5-6]。1989年开始使用同种的弱毒疫苗株预防该病并且取得了很好的效果。弱毒疫苗在预防PPR中发挥了重要作用，但弱毒疫苗存在着散毒和毒力返强的危险，而且疫苗株和野毒株在血清学上无法区分，这就影响到小反刍兽疫流行病学调查。因此，研究一种安全、有效的新型疫苗势在必行。

本研究克隆了小反刍兽疫病毒H基因，构建了PPRV-H基因重组山羊痘病毒，为研究小反刍兽疫基因工程疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

质粒：PtkPgpt-egfpP（本实验室构建的山羊痘病毒通用载体）；病毒：山羊痘病毒（GPV）疫苗毒株购自吉林正亚公司；菌株：DH5α（本实验室保存）；PPRV的cDNA产物（本实验室保存）；原代山羊睾丸细胞（LT，常规方法制作）；培养基为10%血清（北京元亨圣马生物技术研究所）DMEM（Invitrogen公司）；转染试剂为Promega公司的的Mammalian TransFection System-Calcium Phosphate；胶回收纯化试剂盒购自TANGEN公司；各种内切酶为大连宝生物产品。

1.2 小反刍兽疫病毒H基因扩增

以PPRV的cDNA产物为模板，PCR扩增PPRV的H基因。根据GenBank中登录的小反刍兽疫病毒H基因序列。利用DANStar和Primer Premier 5.0软件分析设计了一对引物：

PPRV-P15'-TCA GTCGAC ATG TCC GCA CAA AGG GAA-3'

PPRV-P25'-GCAG ACTAGT TCA GAC TGG ATT ACA TGT T-3'

上游和下游引物分别引入SalⅠ和SpeⅠ酶切位点。

PCR反应体系（25 μL）中各成分 模板：PPRV的cDNA 产物 2 μL；10×PCR buffer（Mg2+Plus）：2.5 μL；dNTPs：2 μL；引物：P1、P2 各 1 μL （25 pmol/μL），r-Taq 酶：0.5 μL，去离子灭菌水：16 μL。

PCR反应参数：95℃5 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃ 2 min，30个循环；72℃延伸 10 min。

1.3 重组质粒PtkPgpt-egfpPpprv-H构建和鉴定

1.3.1 重组质粒PtkPgpt-egfpPpprv-H构建模式

PCR扩增得到的PPRV-H基因用SalⅠ和SpeⅠ酶切，胶回收后，和经过相同酶切处理的质粒PtkPgptegfpP连接，重组质粒命名为PtkPgpt-egfpPpprv-H，EGFP基因在启动子P11的下游，gpt基因位于EGFP基因的下游，PPRV-H基因位于启动子P7.5的下游（图1）。大量制备重组质粒PtkPgpt-egfpPpprv-H，测质粒浓度。

1.3.2 重组质类PtkPgpt-egfpPpprv-H酶切鉴定

分别用三种酶切方法鉴定重组质粒PtkPgpt-egfpPpprv-H

酶切体系 A ddH2O：11 μL，质粒：5 μL，10×H Buffer：2 μL，EcoRⅠ：2 μL；

酶切体系 B ddH2O：11 μL，质粒：5 μL，10×H Buffer：2 μL，SalⅠ：0.8 μL，SpeⅠ：1.2 μL；

酶切体系 C ddH2O：11 μL，质粒：5 μL，10×M Buffer：2 μL，HindⅢ：1 μL，SpeⅠ：1 μL。混匀后 37 ℃水浴2 h，琼脂糖凝胶电泳。

1.4 重组山羊痘病毒的制备，纯化及鉴定

六孔板上铺LT细胞，待细胞长成单层后，GPV疫苗株感染六孔板上长成单层的LT细胞，37℃吸附2 h，钙转染质粒PtkPegfp-gptPpprv-H，转染方法按转染试剂盒的说明（Promega公司）进行。转染12 h后用10%DMSO休克，休克24 h后在荧光显微镜下观察六孔板拿到是否有荧光。待90%细胞病变后收毒。获得的重组病毒在六孔板上进行第一代盲筛。

第一代盲筛后，在含5%血清的DMEM培养基中加入霉酚酸（Mycophenolic acid，MPA，50 μ g/mL），次黄嘌呤（Hypoxanthine，30μ g/mL）和黄嘌呤（Xanthine，500 μ g/mL）进行压力筛选和蚀斑纯化[7-8]。纯化3代后，每代选择有绿色荧光蛋白表达的病毒，提取病毒核酸DNA，用羊痘病毒TK基因的引物作PCR鉴定，若扩增产物为650 bp左右的条带，则说明PPRV-H没有重组进入山羊痘病毒，若扩增产物为3570 bp左右的条带，则说明PPRV-H基因成功插入山羊痘病毒基因组。

2 结果

2.1 PPRV-H基因的PCR扩增

引物PPRV-P1和PPRV-P2扩增产物大小1830bp，与理论值相符（图2）。

2.2 重组质粒PtkPgpt-egfpPpprv-H的鉴定

把重组质类PtkPgpt-egfpPpprv-H用EcoRⅠ单酶切，线性化的重组质粒大小为6500 bp左右，和理论值相符；用SalⅠ和SpeⅠ双酶切后得到的片段大小为1800 bp和4750 bp左右，和理论值相符；用HindⅢ和SpeⅠ双酶切后，得到大小为2435 bp和4750 bp左右的目的片段，和理论值相符（图3）。

2.3 重组病毒rGPV-PtkPgpt-egfpPpprv-H的纯化

10%DMSO休克24 h后，转染重组质粒的细胞孔在荧光显微镜下可以看到大量绿色荧光表达（图4A），阴性对照孔没有绿色荧光表达（图4B）。待90%细胞病变后，收获细胞毒反复冻融3次在六孔板上盲筛一代。从第二代开始，重组病毒反复冻融3次后在96 孔板上做 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个梯度感染 LT细胞。在不完全DMEM培养液中加入霉芬酸，黄嘌呤和次黄嘌呤进行压力筛选。进行3代压力筛选后，即能看见典型的表达绿色荧光的痘斑（图4C）。挑取典型的痘斑继续作梯度稀释在96孔板上传代，直到没有野毒痘斑出现。

2.4 重组病毒的PCR鉴定

提取纯化小反刍兽疫病毒H基因重组山羊痘病毒核酸，用羊痘病毒TK基因引物扩增得到3570bp左右的目的条带。分别用重组质粒rGPV-PtkPgptegfpPpprv-H和GPV病毒核酸做阴性对照和阳性对照（图 5）。

3 讨论

本研究中利用的山羊痘病毒通用转移载体PtkPgpt-egfpP是本实验室构建的，该通用转移载体为背靠背启动子，启动子P11下游克隆了报告基因EGFP和压力筛选基因gpt用于重组病毒的筛选。在启动子P7.5的下游克隆了PPRV-H基因，这样报告基因和外源病毒保护性抗原基因在背靠背启动子作用下，向相反的方向转录，使得重组病毒的克隆纯化和传代方便快捷，又避免了外源蛋白之间的相互干扰，影响外源病毒保护性抗原的免疫原性。

在重组病毒的筛选中，理论上只要出现CPE的细胞都应该是重组病毒，并且有EGFP的表达，但在试验中发现，有的细胞有CPE却没有EGFP的表达，这可能是与MPA的纯度和反复冻融有关，是否因为EGFP和gpt基因融合表达后gpt失去了应用的功效有待进一步研究。所以在该重组病毒筛选中，为了加快筛选进程，在压力筛选的同时做了蚀斑试验，只挑选有绿色荧光蛋白表达的典型痘斑进行传代。

山羊痘病毒的培养只能选用绵羊原代睾丸细胞或肾细胞，本研究中选用的是绵羊睾丸细胞。山羊痘病毒疫苗株在细胞上的生长周期长，病变缓慢，一般都要7～10 d，在TK基因中插入外源基因后产生细胞病变更为缓慢，但原代细胞培养条件要求高，而且传代次数不能太高，超过5代细胞状态明显下降，往往是EGFP刚少量表达，还尚未形成典型的痘斑病变时细胞就从培养板上脱落，延缓了研究进程。因此，为了促进重组山羊痘病毒相关研究的开展，需要建立适合羊痘病毒繁殖的传代细胞系。

在重组病毒的鉴定上，本研究在筛选中进行了3代纯化后，每一代都选择细胞培养孔中有EGFP表达的病毒提取核酸进行PCR鉴定，同时选择没有EGFP表达的孔进行对照，直到只能在有EGFP表达的重组病毒核酸中扩增到目的条带，而没有EGFP表达的GPV核酸中PCR扩增到的只有野毒的条带，这样可以确保扩增到的目的条带不是由于细胞转染中质粒的污染造成的假阳性。

最后，用山羊痘病毒TK基因的引物PCR扩增得到大小为3570 bp左右的目的片段，而提取到的同代次山羊痘病毒疫苗株核酸用TK基因的引物扩增，得到的大小为650 bp左右的目的片段，证明PPRV-H成功插入到山羊痘病毒基因组中，为进一步研究PPRV H基因重组山羊痘病毒免疫原性奠定了基础。

[1]Amjad H，Qamar.Peste des Petits Ruminants in goats in Pakistan[J].Vet Rec，1996，139（5）：118-119.

[2]殷震，刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社，1997.

[3]南文金，王清华，吴晓东，等.小反刍兽疫病毒分子生物学与疫苗研究进展[J].中国动物检疫，2009，26（1）：62-65.

[4]王志亮，包静月，吴晓东，等.我国首例小反刍兽疫诊断报告[J].中国动物检疫，2007，24（8）：24-26.

[5]Taylor WP.Protection of goats against peste des petits ruminants with attenuated rinderpest virus[J].Res Vet Sci，1979，27（3）：321-324.

[6]Taylor WP，al Busaidy S，Barrett T.The epidemiology of peste des petits ruminants in the Sultanate of Oman [J].Vet Microbiol，1990，22（4）：341-352.

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[8]Boyle D B，Coupar BE.A dominant selectable marker for the construction of recombinant poxviruses[J].Gene，1988，65（1）：123-128.