信号通路抑制剂对两株子宫内膜癌细胞生物学行为的影响

邓守恒，吴亚玲，柯贤柱，陈 萍，李 芳，石小燕

子宫内膜癌占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%，其发病率逐年上升。Lax等［1］将内膜癌按发病机制分为两型:Ⅰ型与雌激素相关，占85%;Ⅱ型与雌激素无关，占15%。其中I型最常见的分子水平改变为:人10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白基因 (PTEN)突变缺失及k－RAS基因突变等［2］。已知子宫内膜癌的发生、发展与一些信号通路的活性改变密切相关，其中主要包括表皮生长因子受体 (EGFR)和雷帕霉素靶蛋白 (mTOR)两条通路。当前，抑制相关信号通路已成为肿瘤靶向治疗的热点，故本研究拟以PTEN呈不同表达状态的两株子宫内膜癌细胞株 (PTEN缺失的Ishikawa细胞和PTEN表达完整的HEC－1A细胞)为研究对象，采用 EGFR及mTOR两条信号通路抑制剂进行干预，观察两株子宫内膜癌细胞的生物学行为改变，探讨不同PTEN状态下两条信号通路在子宫内膜癌发生、发展中的可能作用，为进一步明确发病机制，合理选择抗肿瘤药物提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 药品试剂和仪器 表皮生长因子 (EGF)、甲基纤维素(CPS4000)、碘化丙锭 (PI)为Sigma产品;EGFR抑制剂RG－14620(RG)、mTOR抑制剂雷帕霉素 (RA)购自美国Biomol公司;DMEM培养基购自美国GIBCO公司;Transwell小室购自美国Costar公司;BMP型倒置相差显微镜购自日本OLYMPUS公司;Epics Elite ESP型流式细胞仪购自美国Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 两株子宫内膜癌细胞株 (Ishikawa和HEC－1A)由本院临床医学研究所提供，培养于含10%小牛血清的DMEM培养基内，于37℃、饱和湿度，5%CO2条件下培养。两株细胞分别经EGF预处理2 h，并分别给予10 μmol/L RG、10μmol/L RA、10μmol/L RG+10μmol/L RA，另设空白对照细胞 (未给予任何信号通路抑制剂)，倒置显微镜下观察拍照。

1.2.2 细胞克隆法检测细胞增殖 参照文献［3］配制半固体培养基，收集经不同抑制剂处理24 h后的各组细胞，PBS洗去药物，离心1 000 r/min×3 min，用含20%小牛血清的培养液稀释为7.0×103个/ml单细胞悬液，于24孔板预加1.2%甲基纤维素培养基1.0 ml/孔，加入单细胞悬液50μl，使每孔细胞数为350个，每个浓度设4个复孔，混匀后置37℃、5%CO2培养箱中孵育12～14 d后于倒置显微镜下计数细胞克隆数，计算细胞存活率 (给药组平均克隆数/未给药组平均克隆数×100%)。实验重复3次。

1.2.3 流式法检测细胞周期及凋亡 收集消化经不同抑制剂处理24 h后的各组细胞，0.01 mol/L PBS 0.5 ml重悬细胞，加70%乙醇1 ml，－20℃固定24 h，加入PI(终浓度为50 μl/ml)和RNA酶 (终浓度为0.25 mg/ml)，室温下避光孵育30 min后流式细胞仪做DNA分析，以ModFit LT软件分析，拟合计算各时相细胞的百分比。

1.2.4 Transwell法分析细胞侵袭性改变 细胞分组及处理同上，在Transwell小室 (Costar公司)中进行，NIH3T3细胞培养液做趋化液，在上室内加入100μl不含胎牛血清的DMEM，37℃孵育1 h，加入上述各组细胞悬液20μl(调细胞浓度为1.0×105个/ml)，每组4个复孔。37℃ 12 h后取出滤膜，甲醇固定，HE染色。显微镜下计数滤膜外表面的细胞数，每张滤膜随机取5个视野 (×200)取均值，实验重复3次，以相对侵袭抑制率表示肿瘤细胞的侵袭力，相对侵袭抑制率 (%)=(对照组－实验组)/对照组×100%。

2 结果

2.1 细胞形态学观察 未经处理的Ishikawa细胞核大，多形，核仁多个，肥大，胞质内线粒体等细胞器形态正常，经10 μmol/L RG和10μmol/L RA单独或合用处理24 h后，细胞贴壁能力下降，细胞外形发生改变，许多细胞脱落，细胞数量明显减少，细胞表面空泡明显增多，上清液中可见细胞碎片(见图1)，两药合用组效果更为明显。相比之下，HEC－1A细胞则对上述抑制剂处理不太敏感，细胞外形基本未改变，无明显凋亡、生长抑制现象发生 (见图2)。

2.2 两株子宫内膜癌细胞周期分布、凋亡率比较 RG、RA单独作用后的Ishikawa细胞G1期细胞比例均较对照Ishikawa细胞呈明显上升趋势，S期细胞比例明显下降 (p＜0.05)，RG、RA合用，Ishikawa细胞 G1期比例上升更明显 (p＜0.05)，而S期比例则下降更显著 (p＜0.01)。等剂量的RG、RA单独或联合作用HEC－1A细胞后，G1期和S期细胞比例与对照HEC－1A细胞组比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。RG、RA均可诱导 Ishikawa细胞出现凋亡 (p＜0.05)，联合使用凋亡率更高 (p＜0.01)，而RG、RA单独或联合作用对HEC－1A细胞诱导的凋亡作用均不明显 (P＞0.05)。RG、RA单独或联合作用对Ishikawa细胞产生的凋亡率均明显高于相同处理的HEC－1A细胞组 (p＜0.01，见表1)。

图1 Ishikawa细胞对EGFR单独或联合mTOR信号通路抑制剂的光镜下表现 (×200)Figure 1 Change of Ishikawa cell morphology after treatment with signal transduction inhibitor

图2 HEC－1A细胞对EGFR单独或联合mTOR信号通路抑制剂的光镜下表现 (×200)Figure 2 Change of HEC－1A cell morphology after treatment with signal transduction inhibitor

表1 RG与RA单独和合用对两株子宫内膜癌细胞凋亡率和细胞周期分布影响 ，n=4)Table 1 The effect on apoptosis rate and cell phase of two human endometrial carcinoma cell after admistration of RG and RA

表1 RG与RA单独和合用对两株子宫内膜癌细胞凋亡率和细胞周期分布影响 ，n=4)Table 1 The effect on apoptosis rate and cell phase of two human endometrial carcinoma cell after admistration of RG and RA

注:与Ishikawa组比较，*p＜0.05，△p＜0.01;与Ishikawa+RG组比较，▲p＜0.01;与Ishikawa+RA组比较，☆p＜0.01;与Ishikawa+RG+RA组比较，○p＜0.01

类别 G1期细胞(%)S期细胞(%)M期细胞(%)凋亡率(%)Ishikawa 62.1±2.8 35.4±1.5 3.5±0.9 5.1±0.6 Ishikawa+RG 79.5±2.7 16.3±1.8* 4.2±1.1 25.3±1.2*Ishikawa+RA 77.3±1.9 18.7±2.3* 3.7±1.8 19.7±0.9*Ishikawa+RG+RA 85.2±3.1* 8.3±1.2△ 6.6±1.7 32.7±0.8△HEC－1A 67.2±3.2 31.6±1.7 1.7±0.8 3.7±0.7 HEC－1A+RG 69.5±3.1 29.8±2.1 1.2±0.4 5.4±0.6▲HEC－1A+RA 65.8±3.4 27.4±2.7 5.6±3.4 6.9±0.9☆HEC－1A+RG+RA 71.2±2.3 21.9±2.3 6.7±2.6 7.1±0.5○

2.3 抑制剂对两株子宫内膜癌细胞存活率和侵袭力的影响RG、RA单独作用24 h，Ishikawa细胞存活率分别降至 (52.7±5.3)%和 (48.6±4.6)%，与对照Ishikawa细胞存活率相比，差异有统计学意义 (p＜0.05)，RG、RA合用24 h，Ishikawa细胞存活率降至 (28.9±2.7)%，差异有统计学意义(p＜0.01)。RG、RA单独或联合作用24 h后的Ishikawa细胞侵袭细胞数目均较对照Ishikawa细胞组显著下降 (p＜0.01)，细胞侵袭抑制率均明显增加 (p＜0.01)，RG、RA单独或联合作用HEC－1A细胞24 h，细胞存活率、侵袭细胞数目虽较对照HEC－1A细胞有下降趋势，但差异均无统计学意义 (P＞0.05)。经RG、RA单独或联合作用后各组HEC－1A细胞存活率、侵袭细胞数目及侵袭抑制率与相应处理的Ishikawa细胞组比较，差异均有统计学意义 (p＜0.01，见表2)。

表2 RG与RA单独和合用对两株子宫内膜癌细胞存活率和侵袭力影响，n=4)Table2 The effect on survival rate and invasion of two human endometrial carcinoma cell after admistration of RG and RA

表2 RG与RA单独和合用对两株子宫内膜癌细胞存活率和侵袭力影响，n=4)Table2 The effect on survival rate and invasion of two human endometrial carcinoma cell after admistration of RG and RA

注:与Ishikawa组比较，*p＜0.05，△p＜0.01;与 Ishikawa+RG组比较，▲p＜0.01;与Ishikawa+RA组比较，☆p＜0.01;与Ishikawa+RG+RA组比较，○p＜0.01

类别 存活率 (%)侵袭细胞 (n)抑制率 (%)Ishikawa 100 206±20 0 Ishikawa+RG 52.7± 5.3* 117±12△ 43.3±5.6△Ishikawa+RA 48.6± 4.6* 124±19△ 38.9±7.1△Ishikawa+RG+RA 28.9± 2.7△ 94± 6△ 54.3±4.3△HEC－1A 100 227±14 0 HEC－1A+RG 91.3± 9.5▲ 199±21▲ 12.8±2.2▲HEC－1A+RA 89.8±11.2☆ 205±23☆ 10.4±2.9☆HEC－1A+RG+RA 87.6±10.7○ 187±19○ 17.9±4.7○

3 讨论

恶性肿瘤的生物学行为之一是失控性生长，细胞周期出现紊乱导致细胞始终处于增殖状态而不能进入静止期以及细胞凋亡受阻是肿瘤细胞失控性生长得以发生的主要机制［4］。恶性肿瘤转移是指原发灶的肿瘤细胞脱落，随循环移动后与血管、淋巴管内皮细胞黏附、进而侵袭穿过内皮细胞及其基底膜定植形成转移灶［5］，是恶性肿瘤的另一生物学行为。

本研究将EGFR抑制剂RG和mTOR抑制剂RA单独和联合作用于两株不同子宫内膜癌细胞，采用经典方法观察其对细胞生物学行为的影响，结果显示，RG、RA单独作用Ishikawa细胞能明显阻滞细胞周期于G1期并诱导细胞出现凋亡，两种抑制剂合用则G1期阻滞和细胞凋亡更为显著，相比之下，HEC－1A细胞则对上述抑制剂处理不太敏感，G1期细胞比例和凋亡率虽有上升趋势，但均无统计学差异，与镜下观察的细胞形态学改变相一致。细胞克隆和侵袭实验结果显示，HEC－1A细胞对RG、RA单独和联合作用均不敏感，而两种抑制剂单独作用后的Ishikawa细胞存活率和侵袭能力均明显下降，抑制率明显增加，合用两种抑制剂则可进一步降低细胞存活率，抑制细胞的侵袭。经RG、RA单独或联合作用后的各组Ishikawa细胞存活率、侵袭细胞数目及侵袭抑制率与相应处理的HEC－1A细胞组比较，差异均具有显著性。

由上述结果可看出，(1)RG、RA单独或联合使用均可通过阻滞细胞周期于G1期诱导Ishikawa细胞凋亡，两抑制剂合用，细胞凋亡率更高。(2)由于克隆形成法可反映出单个细胞的增殖能力，故RG、RA不仅对增殖期Ishikawa细胞具有诱导凋亡作用，而且还对Ishikawa肿瘤干细胞具有明显的生长抑制作用，这较单纯抑制或杀死癌细胞本身具有更大的参考价值［6］。(3)RG、RA均可降低Ishikawa细胞侵袭力，有效抑制细胞的远处转移，二者合用作用更强。(4)RG、RA单独和合用对Ishikawa细胞作用效果明显，而对HEC－1A细胞相对不明显，说明EGFR和mTOR信号通路仅在PTEN基因表达缺失时才对抑制剂作用敏感，PTEN基因在整合多条信号通路中发挥着重要作用，可通过影响靶分子及其上下游的信号级联反应对细胞生物学行为产生影响，这与赵丽君等［7］将HEC－1A细胞PTEN基因敲减后观察到的细胞生物学行为改变及Blanco等［8］得出的结论一致。

PTEN突变在子宫内膜癌发生中是一个早期事件［9－10］，PTEN在人子宫内膜癌中的突变丢失率可高达60% ～80%［11］，PTEN的丢失又可进一步激活子宫内膜细胞中的磷酸化AKT通路［12］，说明PTEN的缺失突变与子宫内膜癌的形成和发生、发展都有着密切联系。PTEN基因属抑癌基因，定位于染色体10q23.3，由9个外显子和8个内含子构成，其cDNA序列包含由1 209个核苷酸组成的开放阅读框架，编码403个氨基酸组成的蛋白质，可通过双重磷酸酯酶活性负性调控三条途径(PI3K/AKT/mTOR途径、FAK途径和MAPK途径)来调节细胞生长、增殖、凋亡、细胞迁移、血管生长等。本研究结果提示PTEN基因的表达水平还可成为预测相关信号通路抑制剂敏感与否的标志物之一。肿瘤患者在接受化疗前如果能了解此种肿瘤中是哪条或哪几条信号通路起主要作用，就可能有针对性地应用信号通路抑制剂，提高化疗效果。本研究为进一步阐明子宫内膜癌的致病机制，更好地选择信号通路抑制剂治疗目标人群、提高其治疗有效率提供了一个新靶向。

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