藤茶对非酒精性脂肪性肝病的治疗作用研究

王俊杰，舒 洋，曹 欣，蒋显勇，吴海燕，陈福春，方会龙，陈东林

藤茶 (ampelopsis grossedentata)是葡萄科植物蛇葡萄属中的一种野生藤本植物的嫩茎叶，多生长在海拔200～800 m高的山地上，主要分布于广西、广东、云南、贵州、湖南、湖北、江西、福建等地。长久以来，我国壮族和瑶族人将其嫩茎叶制成保健茶，用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疸型肝炎、疮疖等症。其化学成分主要为黄酮类、低聚芪类、酚类［1］，其中黄酮类中的二氢杨梅素含量丰富，在幼叶茎中含量占干重的20%以上，在幼叶中可达40%［2］。我们报道了藤茶及其主要成分二氢杨梅素具有护肝和抗肝纤维化的作用［3－7］，本研究在此基础上进一步研究藤茶提取物对小鼠非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的保护作用，为其保健功效的评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级昆明小鼠48只〔合格证号:Scxk(湘)2009－0012〕，雄性，体质量18～22 g，购自长沙市开福区东创实验动物科技服务部。实验前适应环境3 d，自由饮水。

1.2 仪器和试剂 仪器:Au640型全自动生化分析仪 (日本Olympous公司)，TSJ－O脱水机 (常州市中威电子仪器厂)，BMJ－Ⅲ型包埋机 (常州市中威电子仪器厂)，Olympus显微镜 (日本Olympous公司)。试剂:胆固醇、丙硫氧嘧啶、胆酸钠，均购于上海蓝季生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藤茶提取物的制备 采摘郴州王仙岭后山藤茶，晾干，粉碎，95℃热水提取10 min(料液比1∶20)，过滤。滤渣微波加热3 min后合并滤液，加热提取，过滤，滤液室温下冷却，析出晶体，干燥得藤茶提取物。吸光度法测定纯度:标准品计算药物浓度与吸光度的标准曲线。待测药品溶液加入5%AlCl3溶液3 ml，用95%乙醇定容至10 ml，摇匀后室温静置40 min，在404 nm波长下测定吸光度值，标准曲线计算药物浓度。

1.3.2 造模方法 小鼠高脂饲料喂养，自由饮水。高脂饲料配方:添加2%胆固醇、10%猪油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠到基础饲料中，混合均匀，压制成条。

1.3.3 分组 48只小鼠随机分为4组，每组12只，分别为正常对照组、模型组、阳性对照组及藤茶治疗组。正常对照组:正常方法饲养60 d，普通条形饲料喂养;模型组:高脂饮食60 d制备NAFLD模型;阳性对照组:在模型组高脂饮食的基础上灌胃易善复 (多烯磷脂酰胆碱胶囊)150 mg/kg，从实验第14天开始，1次/d，共治疗42 d;藤茶治疗组:在模型组高脂饮食基础上灌胃藤茶提取物300 mg/kg，从实验第14天开始，1次/d，共治疗42 d。

1.3.4 实验方法 (1)实验第60天处死4组小鼠。动物处死前禁食12 h，称体质量，眼眶内眦取血后分离血清，用全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基转移酶 (AST)、总胆固醇 (TC)、三酰甘油 (TG)。(2)迅速剪开腹腔，观察肝脏形态。取出完整肝脏，滤纸吸干表面水分后称重，计算肝指数，肝指数=肝脏质量 (mg)/体质量(g)×100%。(3)完整分离肝脏左叶，用4%多聚甲醛固定，脱水，包埋，切片，HE染色，封固，光镜下观察肝组织病理变化并进行分级和评分，方法为:在显微镜下肝细胞内含脂滴细胞数/总细胞数比值为0、＜1/3、1/3～2/3、＞2/3～1，分别判定为 － (0分)、+(1分)、++(2分)、+++(3分)、++++(4分)［8］。(4)完整分离肝脏中叶，剪取100 mg，测定肝脏TC、TG。肝脏TC、TG测定方法为:取肝组织加9倍体积的异丙醇，在冰水中制成10%的匀浆，4℃提取24 h，3 000 r/min离心10 min，提取上清液，用全自动生化分析仪测定TG、TC含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计检验。计量资料以表示，多组间均数的比较采用方差分析;等级资料的比较采用秩和检验。p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 藤茶提取物测定 吸光度法测定纯度标准曲线的回归方程为:A=6.21x+0.0105(A为吸光度，x为药物浓度)，R=0.997639。实验用藤茶提取物二氢杨梅素含量为45.01%。

2.2 肝脏形态学观察及肝指数变化 正常对照组小鼠肝脏颜色红润，表面光滑，边缘锐利，包膜完整，质地柔软。模型组小鼠肝脏颜色呈暗褐色，肝脏肿大，质脆，包膜紧张，散在分布白色脂滴，表面均匀分布颗粒状突起。经易善复或藤茶治疗后，小鼠肝脏为褐色，肝脏大小及质地较模型组明显改善，散在少量分布白色脂滴，表面均匀分布颗粒状突起。

正常对照组、模型组、阳性对照组、藤茶治疗组小鼠肝指数分别为 (41.3±4.1)mg/g、(53.5±3.4)mg/g、(48.5±3.6)mg/g和 (48.7±3.1)mg/g，4组间比较差异有统计学意义 (F=21.36，p＜0.05)。模型组与正常对照组比较，阳性对照组与模型组比较，藤茶治疗组与模型组比较，差异均有统计学意义 (p＜0.01);但阳性对照组与藤茶治疗组比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)，这两组与正常对照组比较，差异仍有统计学意义 (p＜0.01)。

2.3 肝组织病理变化 光镜下，正常对照组小鼠肝组织结构正常，肝窦清晰可见，肝索排列整齐，肝细胞无脂肪变性，细胞结构清晰，细胞质丰富，细胞核位于细胞中央。模型组小鼠肝脏呈中或重度脂肪变性，以中央静脉周围明显，肝细胞肿胀呈圆形，细胞核被挤向一边，胞质内充满大量脂肪空泡，脂滴大小不等，甚至融合成大脂滴，界限不清楚。阳性对照组及藤茶治疗组小鼠较模型组脂肪变性细胞明显减少，脂滴减少或消失，肝细胞结构基本恢复正常 (见图1)。

图1 小鼠肝组织切片的形态改变 (HE染色，×100)Figure 1 Histopa－thological changes of mice liver

根据肝脂肪变性程度级别标准，计算肝脂肪变性评分，4组小鼠肝脂肪变性评分比较，差异有统计学意义 (F=16.40，P=0.00);模型组小鼠肝脂肪变性评分显著高于正常对照组，阳性对照组和藤茶治疗组又显著低于模型组，差异均有统计学意义 (p＜0.05)，但阳性对照组与藤茶治疗组比较差异无统计学意义 (P＞0.05，见表1)。

2.4 肝功能及血脂变化 模型组小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平较正常对照组显著升高 (p＜0.01)，阳性对照组和藤茶治疗组小鼠血清中ALT、AST、TC、TG水平较模型组显著降低，差异有统计学意义 (p＜0.05);但阳性对照组与藤茶治疗组小鼠的上述指标比较差异无统计学意义 (P＞0.05，见表2)。

2.5 肝脏TC、TG变化 4组小鼠肝脏组织中TC、TG含量比较，差异有统计学意义 (p＜0.05);模型组小鼠肝脏组织中TC、TG含量较正常对照组显著升高 (p＜0.01);阳性对照组和藤茶治疗组小鼠肝脏组织中TC含量均较模型组显著降低(p＜0.05)，与正常对照组比较差异无统计学意义 (P＞0.05);藤茶治疗组肝脏TG含量较模型组显著降低，差异有统计学意义 (p＜0.05);阳性对照组和藤茶治疗组TG含量与正常对照组比较，差异有统计学意义 (p＜0.01，见表3)。

表1 4组小鼠肝脏脂肪变性情况比较Table 1 Comparison of degrees of hepatic fatty degeneration among the four groups

表2 4组小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平比较Table 2 Comparison of serum ALT，AST，TC，and TG levels among the four groups

表2 4组小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平比较Table 2 Comparison of serum ALT，AST，TC，and TG levels among the four groups

注:与正常对照组比较，*p＜0.01;与模型组比较，△p＜0.05，★p＜0.01

组别 只数 ALT(U/L)AST(U/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)正常对照组 11 48± 7 76±14 2.14±0.25 1.06±0.14模型组 11 162±33* 182±25* 4.12±0.33* 1.32±0.15*阳性对照组 9 110±22＊★ 134±21＊★ 3.82±0.22＊△ 1.11±0.11△藤茶治疗组 10 120±14＊★ 138±17＊★ 3.75±0.20＊△ 1.08±0.14△F 值0.00 0.00 0.00 0.0003 51.09 52.84 126.03 8.20 P值

表3 4组小鼠肝组织TC、TG含量比较Table 3 Comparison of hepatic levels of TC and TG among the four groups

表3 4组小鼠肝组织TC、TG含量比较Table 3 Comparison of hepatic levels of TC and TG among the four groups

注:与正常对照组比较，*p＜0.01;与模型组比较，△p＜0.05

组别 只数 TC(mmol/L) TG(mmol/L)正常对照组 11 0.38±0.08 0.16±0.04模型组 11 0.52±0.03* 0.28±0.05*阳性对照组 9 0.45±0.04△ 0.25±0.01*藤茶治疗组 10 0.40±0.11△ 0.21±0.03＊△F 值＜0.01 ＜0.01 8.46 21.14 P值

3 讨论

NAFLD是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝以及由其演变的非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化。随着人们生活水平的提高及生活方式和饮食结构的改变，NAFLD在我国的发病率越来越高，发病年龄趋向低龄化，已成为一种严重威胁人类健康的疾病。

Day和James提出以氧应激/脂质过氧化为核心的“二次打击”学说［9］，认为:各种状态所致的脂肪沉积与胰岛素抵抗是脂肪性肝炎的第一次打击;而氧化应激/脂质过氧化是脂肪肝病程进展中的第二次打击，二次打击是脂肪变性发展为脂肪性肝炎、肝纤维化及肝硬化的转折点。及时去除病因及诱因、减轻肝脏脂肪沉积，抑制氧化应激可能是防治脂肪性肝炎的有效措施。

我国藤茶资源丰富，来源广泛，其有效成分二氢杨梅素含量丰富，实验采用的藤茶提取物二氢杨梅素的含量为45.01%。本研究发现，藤茶可以明显改善NAFLD小鼠肝脏脂肪变性，具有潜在的治疗NAFLD的作用;还可以降低肝脏TC、TG含量及血清TC、TG、ALT、AST水平，表现出一定的降脂和肝保护作用。此外，有文献报道，藤茶还具有调节免疫、抗炎、抗氧化等作用［10］。因此，长期饮用藤茶具有治疗NAFLD的功效，其机制与藤茶抗炎抗氧化、保护肝脏、减轻肝脏脂质沉积有关。

1 Lu A，Tang Y，Ran R，et al.Brain genomics of intracerebral hemorrhage［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2006，26(2):230－252.

2 李翠苹，曹树稳，余燕影.二氢杨梅素研究进展［J］.化学试剂，2010，32(7):608－612.

3 方会龙，王俊杰，陈美姿，等.藤茶提取物对血吸虫病肝纤维化的影响［J］.中国全科医学，2010，13(6):2004－2006.

4 邝满元，刘映霞，李映菊，等.藤茶总黄酮抗大鼠肝纤维化的作用 ［J］.南华大学学报医学版，2008，36(6):745－747.

5 方会龙，王俊杰，陈美姿，等.二氢杨梅素治疗血吸虫病肝纤维化的实验研究［J］.中国临床药理学与治疗学，2010，15(4):381－384.

6 邝满元，贾蕾，罗明英.二氢杨梅素对肝纤维化大鼠肝功能及肝纤维化指标的影响［J］.中国民族民间医药，2009，8(2):46－47.

7 邝满元，贾蕾，罗明英.二氢杨梅素对肝纤维化大鼠脂质过氧化损伤的保护作用［J］.中国医药导报，2009，6(18):26－28.

8 葛麟，谭正怀，唐大轩，等.轻肝颗粒对小鼠非酒精性脂肪肝的作用研究［J］.中药药理与临床，2009，25(2):94－97.

9 Day CP.Steatohepatitis:a tale of two"hits" ［J］.Gastroenterology，1998，114:842－845.

10 魏来，赵春景.番茄红素对非酒精性脂肪肝模型大鼠肝细胞色素P_ (450)2E1及肿瘤坏死因子－α表达的影响 ［J］.中国药房，2010，33(5):3100－3102.