静脉注射小剂量obestatin对大鼠胰腺外分泌的影响*

孙学成 廖 专 李兆申

第二军医大学长海医院消化科1（200433） 温州医学院附属第一医院消化科2

ghrelin和obestatin是一对来源于同一前体基因preproghrelin的重要肽类激素，经不同翻译后修饰，与不同受体结合，发挥生理学作用。ghrelin由28个氨基酸组成，能促进生长激素分泌，具有刺激摄食、诱导脂肪合成、增加体质量等正向能量代谢调节作用；此外，ghrelin还可刺激胃酸分泌和胃动力，抑制胆囊收缩素-8（CCK-8）刺激引起的胰腺外分泌增加[1]。obestatin由23个氨基酸组成，最初研究发现其具有与ghrelin相拮抗的生理学功能，是一种食欲抑制激素[2]。本实验建立大鼠胰腺外分泌模型，旨在观察静脉注射小剂量obestatin对大鼠胰腺外分泌以及CCK-8刺激引起的胰腺外分泌增加的影响。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

2～3月龄健康雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠24只，体质量200～250 g，购自第二军医大学实验动物中心。实验前大鼠于同一实验室条件下饲养1周：恒定温度和湿度，标准饮食，自由饮水，每天8:00-20:00予日光灯照射模拟昼夜循环。

大鼠 obestatin （Phoenix Pharmaceuticals,Inc.）使用前以0.9%NaCl配制成1 nmol/ml和5 nmol/ml的溶液，分装，－20℃保存；大鼠CCK-8（康肽生物科技北京有限公司）使用前以含1%胎牛血清的0.9%NaCl配制成400 pmol/ml的溶液；BCA蛋白测定试剂盒（BCA Protein Assay Kit,Pierce Protein Research Products,Thermo Fisher Scientific Inc.）。

二、方法

24 只大鼠随机分为三组，分别为 1 nmol·kg-1·h-1obestatin+CCK-8 组（A 组）、5 nmol·kg-1·h-1obestatin+CCK-8（B 组）和 CCK-8组（C 组），每组 8只。 实验前禁食12 h，自由饮水，所有实验均于9∶00开始。

于安静、无菌条件下予大鼠3%戊巴比妥钠15 mg/300 g腹腔内麻醉，分别于右侧股静脉和尾静脉留置静脉导管；腹部正中线切口，将Intima-Ⅱ静脉留置针自十二指肠乳头对侧肠壁经十二指肠乳头开口插入胆胰管，见黄色胆胰混合液（pancreaticbiliary juice,P-BJ）顺畅流出后固定；于十二指肠乳头上方插入Intima-Ⅱ静脉留置针，用以回输P-BJ。红外线烤灯照射使大鼠肛温维持于37℃左右，稳定30 min后开始实验。每15 min经胆胰管插管收集一次P-BJ，以微量进样器测定体积后留取50μl，双蒸水稀释，参照BCA蛋白测定试剂盒说明书测定蛋白含量。由于胆汁中蛋白含量很低，因此P-BJ中蛋白含量的变化可以反映胰液蛋白分泌量，单位时间内胰液蛋白分泌量为该时段P-BJ体积与测得的蛋白含量的乘积。其余部分P-BJ于下一收集时段内经乳头上方留置导管以2 ml/h的速率回输至十二指肠内。

将第一次收集的P-BJ作为基础胰腺分泌，然后A、B组大鼠以微量注射泵经尾静脉持续注射obestatin 直至实验结束（1 nmol·kg-1·h-1和 5 nmol·kg-1·h-1），收集 2 次 P-BJ后（30 min 后），再经股静脉持续注射 CCK-8直至实验结束（400 pmol·kg-1·h-1[1]），收集6次P-BJ。C组大鼠仅经股静脉注射400 pmol·kg-1·h-1CCK-8 作为对照，注射时间同 A、B组。

三、统计学分析

结 果

一、静脉注射小剂量obestatin对P-BJ体积的影响

大鼠基础胰腺分泌量为（136±44）μl/15 min。A、B组尾静脉内注射 obestatin 15 min和30 min后，单位时间内P-BJ体积与基础值相比无明显差异。股静脉内注射CCK-815 min后，三组P-BJ体积均开始升高，于注射后30 min或45 min达高峰，随后缓慢下降，各时点与基础值相比差异均有统计学意义。A、B组各时点单位时间内P-BJ体积与同时点C组相比，差异均无统计学意义（见图1）。

图1 静脉注射小剂量obestatin对P-BJ体积的影响

二、静脉注射小剂量obestatin对胰液蛋白分泌的影响

大鼠基础胰液蛋白分泌量为（11.9±2.2）mg/15 min。A、B组尾静脉内注射obestatin 15 min和30 min后，单位时间内胰液蛋白分泌量与基础值相比无明显差异。股静脉内注射CCK-815 min后，三组胰液蛋白分泌量均开始升高，于注射后45 min达高峰，随后缓慢下降，各时点与基础值相比差异均有统计学意义。A、B组各时点单位时间内胰液蛋白分泌量与同时点C组相比，差异均无统计学意义（见图 2）。

图2 静脉注射小剂量obestatin对胰液蛋白分泌的影响

讨 论

作为ghrelin的相关肽，obestatin自发现以来即成为研究热点，对于其生理学功能存在较多争议。obestatin的发现者Zhang等[2]报道，obestatin能抑制摄食和胃肠功能。外源性obestatin腹腔内注射能时间和剂量依赖性地抑制小鼠摄食量，脑室内注射亦能抑制摄食量；此外，obestatin还能抑制体质量增加，持续抑制胃排空活动，降低空肠肌收缩能力，对体外培养大鼠垂体细胞的生长激素分泌无明显影响。虽然一些研究小组证实了obestatin对摄食和体质量增加的抑制作用[3,4]，但亦有实验未能观察到外源性obestatin对摄食和胃肠动力的影响，对ghrelin刺激摄食和胃肠动力的作用亦无拮抗效应[5～7]，或发现外源性obestatin本身不能调节摄食，但能抑制外源性ghrelin的促进食欲和刺激生长激素分泌作用[8]。有研究[8]发现，虽然ghrelin与obestatin的分泌节律均呈搏动性，但两者的血浆水平并不显著相关，空腹24 h后ghrelin水平显著升高而obestatin水平仅轻微降低；在某些病理状态下如胃旁路术后，两者水平的变化亦不一致[9]。关于obestatin的争议还在于其受体。obestatin的发现者Zhang等[2]报道其受体为G蛋白偶联受体GPR39，这一发现经使用GPR39基因敲除小鼠的动物实验证实[10]。但随后三项通过基因转染技术表达GPR39的实验均未能重复Zhang等[2]的研究结果[5,11,12]，且有研究[11,13]发现obestatin的可能中枢靶器官垂体和下丘脑中并无GPR39表达。

研究[1]发现ghrelin虽可抑制CCK-8刺激引起的胰腺外分泌增加，但对基础胰腺分泌量、基础胰液蛋白分泌和基础淀粉酶分泌均无明显影响。Kapica等[14]则发现大剂量外源性 obestatin（30、100、300 nmol/kg）可增加麻醉大鼠的胰液蛋白分泌和胰蛋白酶活性。上述研究结果并不符合obestatin与ghrelin作用“对立”的理论。Qader等[15]的研究发现，ghrelin和obestatin均能抑制胰岛细胞分泌对胰腺分泌具有抑制作用的胰多肽和生长抑素。因此关于外源性obestatin对胰腺外分泌的影响，目前仍无定论。本实验建立大鼠胰腺外分泌模型，对此作了进一步的研究。

根据Kapica等[14]的研究结果，经静脉给予obestatin 15 min后胰液蛋白分泌即显著增加，并于30 min时达高峰，加之obestatin的血浆半衰期甚短，仅约22 min，因此本实验采用持续静脉内给药方式，使obestatin起效更快，血药浓度更稳定。由于obestatin在1～5 nmol/kg的剂量范围内即可抑制空肠肌收缩[2]，而大鼠体内obestatin的生理浓度远低于此剂量[16]，因此本实验obestatin的剂量选用 1 nmol·kg-1·h-1和 5 nmol·kg-1·h-1。De Spiegeleer等[17]的研究表明，造成obestatin功能研究结论分歧的原因为，源自不同厂商的obestatin，纯度和质量存在差异。本实验选用Ren等[18]的研究中使用的obestatin，该研究小组关于外源性obestatin对大鼠胰岛素分泌影响的研究得出阳性结果。

本实验结果显示静脉注射CCK-8可刺激大鼠的胰液和胰液蛋白分泌，而静脉注射小剂量（1 nmol·kg-1·h-1和 5 nmol·kg-1·h-1）obestatin 对 胰腺外分泌无明显影响，亦不能改变由CCK-8刺激引起的胰腺外分泌增加，与本课题组前期体外实验结果（obestatin不影响胰腺腺泡和胰腺小叶的淀粉酶分泌）一致。胰腺外分泌系由神经、体液因素组成的复杂网络所调控，而本实验又存在一定局限性，因此根据本实验结果仍无法确定obestatin的药理学作用。与Kapica等[14]的研究相比，本实验选用的obestatin剂量较小，因此不能推断其他剂量对胰腺外分泌无影响。Zhang等[2]研究obestatin对胃肠功能的影响时采用腹腔给药，而本实验则采用静脉给药，给药方式亦可能对实验结果产生影响。而且，目前尚不清楚obestatin是否对胰腺外分泌具有双向调节作用。综上所述，静脉注射小剂量obestatin对大鼠胰腺外分泌无明显影响，且不能改变由CCK-8刺激引起的胰腺外分泌增加。今后尚需扩大obestatin的剂量范围并采用不同给药方式，对该结果作进一步论证。

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