氯化锰对大鼠血－脑脊液屏障的损伤作用

敬海明，刘建中，高文晖，赵超英，马 玲，李国君(1.首都医科大学公共卫生与家庭医学学院，北京 100069;.北京市疾病预防控制中心北京市预防医学研究中心北京市食物中毒诊断溯源技术重点实验室，北京 100013)

锰是机体所必需的一种微量元素，但过量可引起暴露时又可引起多巴胺能神经元的损伤，对其机制的探讨，一直以来都是人们研究的热点。尤其是近年来，甲基环戊二烯三羰基锰(methyl－cyclopentadienyl－manganese－tricarbonyl，MMT)作为汽油添加剂的使用而引起的大气锰(MnCl2)污染日益严重，逐渐引起国内外学者对长期低剂量锰暴露研究的重视［1］。有研究报道称，血锰过高时主要通过由脉络丛上皮细胞所形成的血－脑脊液屏障(blood－cerebrospinal fluid barrier，BCB)向脑内转运［2］。BCB 作为锰过量暴露时向脑内转运的重要途径，其损伤发生在多巴胺能神经元之前，研究并掌握锰早期对于BCB的毒性损伤作用及其机制，可以为今后制定职业与环境因素锰及其化合物所致神经退行性疾病的早期有效防治措施提供理论依据。本研究通过观察脉络丛组织的病理形态学改变及BCB的损伤指标脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)白蛋白指数［3］探讨氯化锰对脉络丛(choroid plexus，CP)的损伤作用。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

MnCl2，纯度＞99%，购自美国Sigma公司;白蛋白测试盒(南京建成生物工程研究所);蛋白标准液(南京建成生物工程研究所);KT－354大鼠微量白蛋白ELISA试剂盒(美国Kamiya生物公司);680型全自动酶标仪(美国 Bio－Rad公司);SCOT－Ⅱ BT224型半自动生化分析仪(意大利Biotecnica公司);CH30生物相差显微镜(日本Olympus公司);图像采集分析软件UV－G显微粒度分析系统(北京和众视野科技有限公司);JEM－1230透射电子显微镜(日本Jeol公司);石蜡包埋机、切片机、展片机与自动染色机均为Leica公司产品。

1.2 动物分组与处理

60只5周龄大的SPF级健康雄性SD大鼠，115～135 g，由军事医学科学院提供，动物许可证号:SCXK－1(军)2007－004，随机分成 6 组，每组 10只，分别为氯化锰30 d组、氯化锰90 d组及氯化锰90 d+30 d恢复组与相应的对照组(氯化锰30 d对照组、氯化锰90 d对照组、氯化锰90 d+30 d恢复对照组)。氯化锰组 ip给予无水氯化锰 6 mg(Mn)·kg－1染毒，每周染毒 6 d，周日停染，相应的对照组给予相同剂量的生理盐水处理。

1.3 样本采集

各时间点染毒结束后，经腹腔麻醉后消毒颈部皮肤，用0.45 mm×20 mm的蝶形针经环枕膜穿刺待有落空感时见清亮CSF流出，以注射器轻抽CSF约100 μl注入预冷的Eppendorf管;从下腔静脉抽取血液6～8 ml，注入无肝素处理的血液收集管，室温放置至少0.5 h，600×g离心30 min，分离血清;采集实验组与正常对照组动物双侧侧脑室的脉络丛组织。

1.4 血清白蛋白(SALB)与脑脊液白蛋白(CALB)的检测及CALB指数的计算

SALB采用溴甲酚绿法在BT224型半自动生化分析仪上测定，CALB采用大鼠微量白蛋白ELISA试剂盒按说明书操作后以全自动酶标仪进行测定，CALB指数=CALB/(SALB×10－3)。

1.5 光镜、电镜下观察脉络丛细胞形态

各组取3只大鼠的脉络丛用生理盐水彻底冲洗后合并，常规的4%甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，制作成病理切片标本，每组至少10张，光镜下观察组织和细胞形态变化。

1.6 透射电镜观察脉络丛上皮细胞超微结构

各组分别将2只大鼠的脉络丛用2.5%戊二醛固定，再用1%锇酸后固定，通过丙酮系列(30%，50%，70%，90%，100%)脱水，包埋在 Epon812中，制成超薄切片，用柠檬酸铅及醋酸铀染色，在透射电镜下观察细胞超微结构的变化(每组至少观察5张)。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 锰对大鼠脑脊液白蛋白，血清白蛋白及脑脊液白蛋白指数的影响

氯化锰组CALB与CALB指数与其相应的对照组比较均明显升高(P＜0.05);氯化锰30 d组的CALB与CALB指数低于氯化锰90 d和氯化锰90 d+30 d恢复组，差异有统计学意义(P＜0.05)，氯化锰90 d组CALB与CALB指数低于氯化锰90 d+30 d恢复组，但差异无统计学意义(表1)。

表1 锰对大鼠脑脊液白蛋白(CALB)，血清白蛋白(SALB)及脑脊液白蛋白(CALB)指数的影响Tab.1 Effect of manganese on CSF albumin(CALB)，serum albumin(SALB)and CSF albumin index(CALB index)in rats

2.2 锰对大鼠脉络丛组织及上皮细胞形态的影响

各对照组脉络丛组织结构清晰，上皮细胞排列整齐，细胞核大而圆，染色质均匀，位于细胞中央，细胞质染色较浅，细胞基底部可见毛细血管(图1A)。染氯化锰30 d后，脉络丛上皮细胞的排列开始出现紊乱，有的细胞核浓染变形，可见细胞肿大现象，脉络丛上皮与其基底部的血管之间部分脱落(图1B)。染氯化锰90 d后脉络丛组织混乱，上皮细胞之间界限不清，细胞核大小不一，有的缺失，胞浆絮状，血管与上皮之间完全脱落(图1C)。染氯化锰90 d后无处理观察30 d后脉络丛组织的改变更加明显，细胞萎缩，胞膜不清，细胞核发生浓缩、碎裂、溶解等，类似于“凋亡细胞”的死亡现象，细胞间的连接部分消失等(图1D)。由此可见，随染氯化锰时间的延长脉络丛的损伤性改变逐渐加重，并且在脱离氯化锰接触30 d后仍然表现为损伤持续性加重的特征。

2.3 锰对大鼠脉络丛细胞超微结构的影响

图1 锰对大鼠脉络丛病理组织学的影响 (HE ×100).分组处理见表1.A:氯化锰30 d对照组;B:氯化锰30 d组，脉络丛上皮扁平，细胞排列紊乱;C:氯化锰90 d组，脉络丛组织形态模糊不清，细胞核大小不一，有的缺失;D:氯化锰90 d+30 d恢复组，细胞胞膜不清，胞核浓缩、溶解，细胞间连接模糊.Fig.1 Effect of manganese on histopathological changes in choroid plexus of rats(HE ×100).

如图2～图4所示，各对照组侧脑室的脉络丛上皮细胞正常，核大而圆，胞质内线粒体丰富，上皮细胞间近游离端可见完整的紧密连接结构，并且上皮细胞游离端多不规则，自质膜衍生出许多微绒毛，排列整齐，上皮下为富含毛细血管的基质。各氯化锰处理组脉络丛上皮细胞均发生不同程度的改变，表现为暗细胞数增加，细胞核浓缩深染，核膜皱缩变形，细胞质空泡增加，微绒毛缺失，溶酶体增加，粗面内质网肿胀，以及细胞间紧密连接间隙变宽、断裂，甚至消失，随染氯化锰时间延长，损害加重，并在脱离氯化锰接触30 d后仍有进行性加重的趋势，呈现出氯化锰毒性病程依赖性模式。

图2 锰对大鼠脉络丛上皮细胞细胞核(N)、线粒体(M)与溶酶体(L)的影响.分组处理见表1.A:氯化锰30 d对照组;B:氯化锰30 d组，胞核变小，核膜皱缩变形，线粒体空泡样改变，溶酶体破裂变小;C:氯化锰90 d组，胞核皱缩变形，线粒体空泡样改变，嵴有脱落现象，溶酶体破裂变小;D:氯化锰90 d+30 d恢复组，核膜皱缩，染色质浓染，似凋亡，线粒体肿大，嵴脱落，可见大量空泡，溶酶体增加.Fig.2 Effect of manganese on nucleus(N)，mitochondria(M)and lysosome(L)in choroid plexus epithelia of rats.

图3 锰对大鼠脉络丛上皮细胞微绒毛(MV)的影响.分组处理见表1.A:氯化锰30 d对照组;B:氯化锰30 d组微绒毛肿大;C:氯化锰90 d组微绒毛排列紊乱;D:氯化锰90 d+30 d恢复组微绒毛缺失，排列紊乱.Fig.3 Effect of manganese on microvilli(MV)in choroid plexus epithelia of rats.

3 讨论

BCB主要是由室管膜内陷于第三、四脑室与侧脑室分化形成的脉络丛组织上皮细胞间的紧密连接所构成，专司外周血循环与CSF循环之间的物质转运［4］。脉络丛组织由脉络丛上皮与富含有窗毛细血管的基质构成，其上皮细胞是立方形或矮柱形细胞，细胞表面有许多微绒毛，细胞核大而圆，胞质内有丰富的线粒体［5］。脉络丛上皮为一具有活性的界面，不仅可以通过其表面的微绒毛分泌CSF，而且在保护脑组织免受一些血液中的内源性与外源性有害物质损害方面也起着非常重要的作用［4］。当血液中的有毒物质(如重金属氯化锰等)水平增高时，脉络丛可以通过结合蓄集的方式阻止其进入CSF［6］。但是，脉络丛对外源性物质的结合能力是有限的，当有毒活性物质蓄积到一定量时便会破坏脉络丛的结构和功能［7］，血清中有毒金属与非金属离子就失去了结合位点而不受限制地进入CSF［8］，使神经系统的代谢及功能发生紊乱，并引起一系列神经生理生化改变。

本研究应用光镜与透射电镜观察了氯化锰对脉络丛的病理形态学影响，结果发现脉络丛是氯化锰过量暴露时一个重要的靶部位，氯化锰可致脉络丛上皮细胞发生不规则萎缩变小，微绒毛结构紊乱、缩短，胞浆内出现空泡、核质凝聚，线粒体结构破坏，细胞之间的紧密连接出现部分断裂与消失等，并且这些改变随染氯化锰时间的延长表现为加重的趋势，即使在恢复期仍可进行性加重。说明锰可以蓄积在脉络丛中，且脉络丛蓄积锰的作用有一定的限度，当超过限度时，可引起脉络丛结构变化影响其屏障功能完整性。

CSF中约90%的成分来源于脉络丛组织的分泌［9］。脑脊液对脑组织具有支持、保护与营养作用，正常生理状态下，其成分受BCB的严格调控而保持相对稳定，但是，在脑组织发生老化以及神经退行性疾病时CSF中的一些血源性蛋白分子含量会增加，可以作为反映BCB损伤的指数［10］，如CSF白蛋白指数等［11］。本研究结果发现，染氯化锰可以引起CALB浓度以及CALB指数升高，升高水平与染氯化锰时间长短以及脉络丛组织的病理结构改变呈正相关，说明CALB浓度及CALB指数可以作为判断氯化锰对BCB损伤程度的参考指标，可以为今后制定作为职业与环境因素的氯化锰及其化合物所致神经退行性疾病的早期有效防治措施提供理论依据。

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