邻苯二甲酸二乙基己基酯对胎鼠肺发育的抑制作用

高 原，陈金妮，陈尚勤，蔡晓红，陈国荣，林振浪

(1.浙江省金华市中心医院儿科，浙江金华 321000;2.海南省人民医院儿科，海南海口 570100;3.温州医学院附属育英儿童医院，浙江温州 325027;4.温州医学院附属一院病理科，浙江温州 325027)

邻苯二甲酸二乙基己基酯 (diethylhexylphthalate，DEHP)是一种增塑剂，以往认为其无毒，所以广泛用于硬质的乙烯聚合物(polyvinyl chloride，PVC)产品，如食物包装袋、医疗设备、婴儿玩具、建筑材料和日常用品等，同时也是胶黏剂、气雾剂、涂料、印刷油墨和美容化妆品中的重要成分［1］。DEHP疏松地结合于PVC，在使用过程中以及随着时间的推移，大多数DEHP释放到环境中，且残留期较长，生物对其也有较强的富集作用。黄晓群等［2］测定人体血清中5种环境内分泌干扰物残留量，以DEHP最高。动物实验结果表明，DEHP能通过胎盘［3］，孕鼠如暴露于 DEHP会导致下一代生殖系统损害［4－5］。DEHP对胚胎肺发育影响的研究较少，体外细胞培养实验已发现，鸡胎肺培养中加入DEHP会导致胚胎肺体积变小及发育不成熟［6］，但作用机制尚不清楚。

基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)对于胚胎期肺发育，尤其肺泡成熟起至关重要的调控作用，基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(tissue inhibitors of metalloproteinase-2，TIMP-2)是 MMP-2特异性天然抑制剂［7－8］。本研究观察孕鼠染毒 DEHP后胎鼠肺发育情况及 DEHP对 MMP-2，VEGF和 TIMP-2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂及仪器

DEHP，纯度99%，购自美国 Sigma公司，批号CAS 117-81-7;MMP-2为鼠抗人单克隆抗体、TIMP-2为兔抗人多克隆抗体、VEGF为鼠抗人单克隆抗体、即用型非生物素免疫组化ElivisionTMplus检测试剂盒和酶底物显色剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。MDF-328E型超低温冰箱，日本Sanyo公司;1169型生物安全柜，美国Thermo Forma公司;液氮罐，温州医学院机能实验中心;FA2104型电子分析天平，上海仪器设备厂;DSHZ-300恒温水浴箱，江苏太仓实验设备厂;KD-BM4生化组织包埋机，浙江科迪实验设备厂;V2088型超薄切片机，美国LKB公司;CX21FS1型光学显微镜，日本Olympus公司;H-7500型透射电镜，日本Hitach公司;Image Proplus 6.0医学图像分析系统，美国 Media Cybernetics公司。

1.2 动物及分组处理

Sprague-Dawley大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号:SCXK(沪)2003-0003，于温州医学院实验动物中心SPF级实验室内饲养。雌性体质量为250～300 g，雌雄鼠按2∶1合笼交配，次日晨发现白色阴栓者为妊娠的第1天。孕鼠共34只，随机分成4组，正常对照组每天ig给予0.5 ml玉米油，其他各组每天 ig给予0.5 ml含DEHP的玉米油，分别相当于给予DEHP 10，100和750 mg·kg－1，至自然分娩，取第1 天仔鼠。

1.3 仔鼠体质量测量和肺样本制备

随机取每只孕鼠的仔鼠3只，称量体质量，比较各组体质量改变情况。再随机取其中2只仔鼠，ip注射戊巴比妥钠35 mg·kg－1麻醉后处死。取出肺组织，分离剪去肺门部大支气管和血管，用25号针插入右肺支气管，取4%甲醛用20 cm H2O的压力灌注，固定，制备光镜和免疫组化标本。

1.4 光镜观察肺组织形态、测量辐射状肺泡计数及肺间质比例

将上述固定的右肺中叶组织，常规脱水、浸蜡、包埋，切片厚5 μm，HE染色，光镜观察肺病理形态学变化。每只仔鼠的肺样本切片5张，每张切片随机选择6个视野，分别测量:① 辐射状肺泡计数(radical alveolar counts，RAC)，即呼吸性细支气管中心至最近的纤维隔垂直线上的肺泡数目，取平均值，参考Jarfelt等［9］方法;② 肺间质比例，去除切片中的大血管和支气管，数字图像分析技术分割图片，调整照片到肺间质和肺泡对比最强烈的像素阈值T，T=100，根据每个图像位点的像素不同，分割图片为肺间质和肺泡，根据肺间质的像素总和计算肺间质的比例。

1.5 免疫组化法检测 MMP-2，TIMP-2和 VEGF的表达

将上述石蜡包埋的右肺中叶组织，每只仔鼠的肺样本切片3张，石蜡切片脱蜡至水，按试剂盒提供的实验步骤进行操作，PBS代替一抗作阴性对照。阳性反应为胞浆中有棕黄色颗粒沉积。随机选取5个视野，应用Image ProPlus 6.0图像分析软件测定阳性染色，采用吸光度值(absorbance，A)表示蛋白表达。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 孕鼠染毒邻苯二甲酸二乙基己基酯对仔鼠体质量的影响

DEHP 750 mg·kg－1组2 只孕鼠在第17、19 天发生流产，1只仔鼠死亡。每窝随机取第1天出生的仔鼠3只，表1体质量测定结果显示，与正常对照组相比，DEHP组仔鼠体质量均下降(P＜0.01);DEHP 750 mg·kg－1组与 DEHP 10，和 100 mg·kg－1组相比体质量下降明显(P＜0.05)，说明孕鼠染毒剂量越高，仔鼠体质量减轻越明显。

表1 孕鼠染毒邻苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)对仔鼠的体质量的影响Tab.1 Effec of di-(2-ethylhexyl)phthalate(DEHP)on body mass in rat pups

2.2 孕鼠染毒邻苯二甲酸二乙基己基酯对仔鼠肺形态、辐射状肺泡计数及肺间质比例的影响

与正常对照组(图1A)比较，在光镜下，DEHP 10和100 mg·kg－1组肺泡形态发育无明显改变，未见炎症反应、渗出及出血(图1B，1C)，DEHP 750 mg·kg－1组可见肺间质增厚，间质细胞增多，肺泡数目减少，肺泡体积增大(图1D)。与正常对照组相比，仅 DEHP 750 mg·kg－1组 RAC 减小，肺间质比例增大(P ＜0.05)(表2)。

2.3 孕鼠染毒邻苯二甲酸二乙基己基酯对仔鼠肺组织MMP-2，TIMP-2和VEGF表达的影响

图1 孕鼠染毒DEHP对仔鼠肺形态的影响 (HE×100).孕鼠处理及仔鼠的选取见表1.A:正常对照;B:DEHP 10 mg·kg－1;C:DEHP 100 mg·kg－1，肺泡形态发育无明显改变，未见炎症反应、渗出及出血;D:DEHP 750 mg·kg－1，肺间质增厚，间质细胞增多，肺泡数目减少.Fig.1 Effect of DEHP on lung histology in rat pups(HE ×100).

表2 孕鼠染毒DEHP对仔鼠辐射状肺泡计数(RAC)及肺间质比例的影响Tab.2 Effect of DEHP on lung radical alveolar counting(RAC)and interstitial tissue proportion in rat pups

仔鼠肺组织中MMP-2的表达和MMP-2/TIMP-2比值随孕鼠染毒DEHP剂量的增加而增多(P＜0.01)。与正常对照组相比，DEHP 100和 750 mg·kg－1组 TIMP-2 的表达减少(P ＜ 0.01);VEGF表达差异无统计学意义(表3，图2)。

图2 孕鼠染毒DEHP对仔鼠基质金属蛋白酶-2(MMP-2)(A)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)(B)和血管内皮生长因子(VEGF)(C)表达的影响(免疫组化 ×400).1:正常对照;2，3 和4:DEHP 10，100 和750 mg·kg－1组.Fig.2 Effcet of DEHP on the expressions of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)(A)，tissue inhibitor of metalloproteinase-2(TIMP-2)(B)and vascular endothelial growth factor(VEGF)in rat pups(C)(Immunohistochemistry ×400).

表3 孕鼠染毒DEHP对仔鼠基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)表达比较Tab.3 Effect of DEHP on the expression of MMP-2，TIMP-2 and VEGF in rat pups

3 讨论

本研究结果说明，孕鼠染毒DEHP会影响胚胎的正常生长发育，影响的严重程度与染毒DEHP剂量的大小密切相关。以往研究表明，每天给予孕鼠DEHP≥750 mg·kg－1时，胚胎的生长发育就会受到影响［10－11］，而本研究中孕鼠染毒 DEHP 10 mg·kg－1时，胚胎的生长发育即受到抑制，这可能与实验动物的基因和所处的环境不同有关，也可能是实验动物本身就存在较高的DEHP基础暴露。具体原因有待进一步研究。

Magliozzi等［12］报道，孕鼠从孕 15 d 至分娩后2 d每天饲以含 DEHP 1000 mg·kg－1的饲料，分娩后以乳汁喂养仔鼠，发现2日龄仔鼠肺泡数目减少，气体交换面积减少。本研究中也发现随孕鼠染毒DEHP剂量的增大，仔鼠肺实质出现相似的变化。本实验还采用RAC和肺间质比例，与光镜下观察到的病理改变一致，仅DEHP 750 mg·kg－1组的仔鼠肺间质比例增大，RAC减小，说明DEHP对鼠胎肺发育有抑制作用。孕鼠在分娩前1周开始摄入含1%DEHP的饮食后，发现14日龄仔鼠肺泡简单化，气体交换面积减少，间质细胞和上皮细胞增生明显［14］。

MMP-2和MMP-2/TIMP-2的平衡对肺发育起重要作用［7，14］。研究证实，在高氧暴露下，过度增强的MMP-2活性和MMP-2/TIMP-2表达失衡可阻滞肺泡发育，可能是新生大鼠高氧肺损伤的发生机制之一［7，15］。本研究中，仔鼠肺组织 MMP-2 的表达和MMP-2/TIMP-2比例随孕鼠染毒DEHP的剂量增加而增加，DEHP 750 mg·kg－1组的仔鼠肺组织出现明显的病理改变，提示在小剂量DEHP染毒剂量下，虽然MMP-2表达和MMP-2/TIMP-2比例有所增加，但在此表达水平时尚未引起肺形态学的改变;当大剂量DEHP染毒时，MMP-2表达和MMP-2/TIMP-2比例增加达到一定程度，此时引起了仔鼠肺发育明显的异常。与新生鼠高氧暴露肺损伤模型研究结果类似［7，15］。因此推测 MMP-2 过度表达和 MMP-2/TIMP-2失衡可能是DEHP影响肺泡发育的作用机制之一。

肺泡和微血管充分发育，是肺发育的两个重要方面，而肺内血管生成是肺发育的关键。VEGF是作用于血管内皮细胞的特异丝裂原，在胎儿后期肺血管和肺泡的发育中起至关重要的作用［8］。本研究中仔鼠肺组织VEGF的表达并不随孕鼠染毒DEHP的剂量增加而变化，而且与正常对照组比较无统计学意义，说明DEHP对肺发育的抑制可能并非通过影响VEGF表达这一途径。

综上所述，孕鼠染毒DEHP时对胚胎生长有抑制作用，抑制程度与剂量成正比，在高剂量下会抑制胎肺发育，其作用机制可能与MMP-2过度表达和MMP-2/TIMP-2平衡关系的破坏有关。

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