格拉司琼对咯利普兰致呕吐、抗抑郁及增强学习记忆能力的影响

李国熊，周 涛，周 恒，许重远，徐江平

(南方医科大学1.药学院神经药理学科，2.南方医院国家药物临床试验机构，广东广州 510515)

咯利普兰(rolipram，Rol)为磷酸二酯酶－4(phosphodiesterase 4，PDE4)高效选择性抑制剂，在动物实验及临床试验中证明了它对大多数抑郁症疗效明确，同时还具有增强动物学习记忆、改善认知等多种功能［1］。但是Rol带来的不良反应特别是恶心呕吐令健康志愿者和抑郁症患者难以忍受，从而限制了它的临床应用［2］。虽然在Rol的基础上合成了一些效价强度更高的化合物如吡拉米司特(piclamilast)，CDP840，但是仍然避免不了恶心呕吐的不良反应［3］。因此，如何减轻或者避免恶心呕吐不良反应成为开发PDE4抑制剂作为抗抑郁药物的难点。格拉司琼(granisetron，Gra)，为高选择性 5－羟色胺 3(5－hydroxytryptamine 3，5－HT3)受体拮抗剂，通过拮抗中枢化学感受区及外周迷走神经末梢的5－HT3受体而抑制恶心呕吐的发生［4］。

动物实验中，常规用猫、狗和雪貂等评价呕吐反应。由于啮齿类动物不具有呕吐反射，Robichaud等［5］发现PDE4抑制剂部分通过模拟α2肾上腺素能受体拮抗剂的药理作用而剂量依赖性地缩短氯胺酮/赛拉嗪诱导麻醉的大鼠翻正反射恢复时间，认为这与PDE4抑制剂潜在致呕吐作用有关，由此提出了专门用于啮齿类动物评价PDE4潜在致呕吐作用的一种新方法。此模型常用来评价新合成的PDE4抑制剂潜在致呕吐反应［5－6］:麻醉时间越长，PDE4抑制剂致呕吐的潜能越小;时间越短，抑制剂致呕吐的潜能越大。本研究采用该模型间接探讨Rol合用Gra潜在致呕吐作用，同时评价Gra对Rol抗抑郁、增强学习记忆能力效应的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、药品、试剂及仪器

昆明小鼠，雄性，体质量18～22 g，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK粤2006－0015。Gra、赛拉嗪(Sigma－Aldrich 公司);Rol(宁波市天衡制药有限公司)，批号:090905;聚乙二醇200(PEG200)(阿拉丁试剂公司)，批号:26440;氯胺酮(福建古田药业有限公司);草酸艾司西酞普兰(escitalopram oxalate，ESC)(广东佐森生物科技开发有限公司)，批号:20070403;Morris水迷宫，中国科学院药物研究所。

1.2 Rol最佳致小鼠呕吐反应剂量的判定

昆明小鼠，分为4组，每组12只，即:麻醉对照组，Rol 0.05，0.5 和 5 mg·kg－1组。按照分组分别sc注射60%PEG200 或Rol 0.05，0.5 和5 mg·kg－115 min后，各组小鼠均单次ip注射按氯胺酮70 mg·kg－1和赛拉嗪 10 mg·kg－1的混合液。待小鼠翻正反射消失后，以仰卧位放置。记录翻正反射持续消失时间。翻正反射恢复的判断标准为:小鼠自主醒来不再仰卧，实验者将其放回仰卧位后30 s内自动翻回俯卧位，如此一共连续3次，即判断为翻正反射恢复［3］。取时间最短的Rol剂量进行后续实验。

1.3 观察Gra对Rol致呕吐反应的影响

昆明小鼠，随机分成6组，每组12只，即:麻醉对照组，Rol 0.5 mg·kg－1组，Gra 0.5 mg·kg－1和 Rol 0.5+Gra 0.05，0.5 和 5 mg·kg－1组。小鼠 ip 注射生理盐水或Gra，45 min后，sc注射60%PEG200或Rol，15 min后，各组小鼠均单次 ip注射氯胺酮70 mg·kg－1和赛拉嗪 10 mg·kg－1的混合液，记录翻正反射消失持续时间。

1.4 小鼠强迫游泳实验

昆明小鼠，随机分成6组，每组12只，即:正常对照组，Rol 0.5 mg·kg－1，Rol 0.5+Gra 0.05，0.5和 5 mg·kg－1组，阳性对照 ESC 10 mg·kg－1组。小鼠分别先 ip生理盐水或 Gra，45 min后，sc注射60%PEG200或Rol或 ESC，45 min后，将小鼠单独置于直径12 cm，水深15 cm，水温为25℃的圆形玻璃容器的水中，记录小鼠在6 min内后4 min的累计不动时间。

1.5 小鼠悬尾实验

分组和给药同1.4，将鼠尾(在距离尾尖1 cm处)夹住，使其呈倒立状态，距离地面约40 cm，用塑料桶将其隔离起来。观察记录6 min内后4 min小鼠累计不动时间。

1.6 Morris水迷宫实验

分组同1.3，先ip注射Gra或生理盐水，45 min后sc注射Rol或其溶剂，再过45 min后，开始Morris水迷宫训练，在直径为120 cm、深度为50 cm，水温为(23±2)℃的水池中，放置一个直径为10 cm的平台，水面高出平台2 cm。人为地将水池平均划分为四个象限，即分别为象限1，2，3，4，每个象限中固定一个点为入水点。将小鼠面向池壁放入水中，待小鼠找到平台之后，让其在平台上停留20 s，如果小鼠在90 s内未找到平台，将其引至平台停留20 s，每天4个位点入水，连续训练4 d，记录第4天小鼠自入水点到登陆平台的逃避潜伏期。第5天撤去平台进行空间探索实验，记录小鼠90 s内穿越原平台次数及平台所在象限探索时间比率。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 Rol对氯胺酮/塞拉嗪麻醉小鼠翻正反射消失持续时间的影响

表1结果显示，不同剂量的Rol 0.05，0.5和5 mg·kg－1麻醉时间不同(F=3.462，P=0.024)。麻醉对照组小鼠平均需要49 min才恢复翻正反射，给予不同剂量的Rol后恢复翻正反射需要的时间均明显缩短。依据本实验结果，采用 Rol 0.5 mg·kg－1进行后续研究。

表1 咯利普兰(Rol)对氯胺酮/塞拉嗪麻醉小鼠翻正反射消失持续时间的影响Tab.1 Effects of rolipram(Rol)on the duration of anesthesia induced by the combination of ketamine/xylazine in mice

2.2 Rol联合Gra对氯胺酮/塞拉嗪麻醉小鼠翻正反射消失持续时间的影响

与麻醉对照组相比，单独 Rol 0.5 mg·kg－1组翻正反射消失持续时间明显缩短(P＜0.01)，联合Gra 0.5 和5 mg·kg－1后，时间明显延长(P ＜0.033)，而单独使用Gra组的翻正反射消失持续时间与麻醉对照组接近(表2)。

2.3 Rol联合Gra对小鼠游泳不动时间、悬尾不动时间的影响

与正常对照组相比，单独注射Rol后小鼠强迫游泳实验的不动时间明显降低(P=0.031)，提示Rol具有抗抑郁活性。合用 Gra 0.05 ～0.5 mg·kg－1后，不动时间与单独使用Rol组间无显著差异(F=1.459，P=0.240)。ESC 0.5 mg·kg－1组小鼠不动时间明显短于正常对照组，与各用药组相当。提示小鼠强迫游泳实验中Rol能显著降低小鼠游泳不动时间，而Gra对其无影响(表3)。与悬尾实验中正常对照组小鼠不动时间相比，单独给予Rol后小鼠的不动时间明显降低(P=0.038);若先注射Gra 0.05～0.5 mg·kg－1后给予 Rol，各组的不动时间与单独使用 Rol比较无显著差异。ESC 0.5 mg·kg－1组小鼠不动时间明显短于正常对照组，与各用药组相当。提示小鼠悬尾实验中单独使用Rol能显著降低小鼠悬尾不动时间，而Gra并不影响Rol缩短悬尾不动时间的效应(表3)。

表2 Rol与格拉司琼(Gra)合用对氯胺酮/塞拉嗪麻醉小鼠翻正反射消失持续时间的影响Tab.2 Effects of Rol combined with granisetron(Gra)on the duration of anesthesia induced by the combination of ketamine/xylazine in mice

表3 Rol与Gra合用对强迫游泳和悬尾实验中小鼠累计不动时间的影响Tab.3 Effects of the combination of Rol and Gra on immobility time in forced swimming and tail suspension test in mice

2.4 Gra对Rol增强空间记忆能力的影响

经过4 d寻找隐藏平台训练，各组小鼠的逃避潜伏期均迅速下降。重复测量的方差分析显示，从第2天开始，每天均较前一天进步(P＜0.05)。在第4天，与正常对照组比较，单独使用Rol组、Gra和Rol合用组均显著降低小鼠第4天自入水点至平台的逃避潜伏(P＜0.05)，单独Gra不影响小鼠的逃避潜伏期(P=0.409)。单独使用Rol组和联合使用Gra各组之间无显著差异(F=0.038，P=0.990)，提示Gra对Rol缩短小鼠逃避潜伏期的能力无影响(表4)。

表5结果显示，正常对照组小鼠在撤去平台后穿越原平台次数平均为(1.7±1.1)次，单独给予Gra以及联合 Rol 0.05 mg·kg－1处理后，穿越平台次数组无显著增加，其余各组穿越平台次数明显增多(P＜0.05)。同样的趋势表现在原平台象限探索时间的比率上。仅注射Rol后的平均比率从正常对照组的(31±12)%上升到(41±10)%(P=0.007)，合用Gra不影响Rol对探索时间比率的增加(F=0.153，P=0.927)。Morris水迷宫实验结果提示Gra不影响Rol的改善空间学习记忆的能力。

表4 Rol与Gra合用对Morris水迷宫中小鼠逃避潜伏期的影响Tab.4 Effects of the combination of Rol and Gra on escape latency

表5 Rol与Gra合用对Morris水迷宫中小鼠穿越原平台次数和原平台象限探索时间的比率的影响Tab.5 Effects of the combination of Rol and Gra on the number of crossings and time spent in the target quadrant in Morris water maze in mice

3 讨论

本实验采用昆明小鼠来间接评价Rol潜在恶心呕吐反应，结果发现不同剂量的Rol均缩短小鼠的麻醉时间，剂量为 0.5 mg·kg－1时，小鼠翻正反射恢复需要的时间最短，而且该剂量的Rol有较好的抗抑郁和改善空间学习认知效应，此外，0.5 mg·kg－1尚不足以引起小鼠自主活动抑制［7］，因此，在后续实验中用 Rol 0.5 mg·kg－1作为最终剂量。

Rol+Gra 0.05，0.5 和 0.5 mg·kg－1组相对于单独的Rol组的小鼠的翻正反射恢复需要的时间延长，但是并没到达麻醉对照组的水平。这可能由于PDE4抑制剂不仅通过α2受体途径，同时神经激肽1受体，5－HT等受体也参与调节恶心呕吐反应［8－9］。Rol合用 Gra 后，阻断 5－HT3受体，而 α2肾上腺素能受体和神经激肽1受体未被阻断，所以表现为麻醉时间有一定延长，但是尚未达到麻醉对照组的水平。Robichaud等［10］用雪貂进行呕吐实验也证实了5－HT3拮抗剂昂丹司琼可以部分逆转PDE4抑制剂诱导的呕吐反射次数，和本实验吻合，提示5－HT3也参与了调节PDE4抑制剂引起的呕吐反应。

在小鼠悬尾实验中，Rol联合Gra后，抗抑郁活性增强，提示Gra与Rol可能有协同增效的作用，在小鼠强迫游泳实验中，出现类似的趋势。遗憾的是，在抗抑郁评价实验中，因为小鼠数量不够，没有用单独的Gra进行实验，所以不能验证Gra本身是否具有一定的抗抑郁作用。

此外，一些文献报道，5－HT3抑制剂具有抗抑郁、减轻焦虑、减少恶心、增强记忆的功能，但其效果和作用机制尚不明确。有人认为抗抑郁作用与突触前 5－HT3A和突触后 5－HT3B有关［8］，在研究嗅觉的学习记忆功能时［11］，发现嗅球的5－HT通过细胞外信号调节激酶(ERK)和CREB结合蛋白途径调节嗅觉学习记忆功能，5－HT3抑制剂是否也通过ERK和CREB结合蛋白途径产生抗抑郁、提高学习记忆能力的作用尚不明确，有待进一步研究。

Rol+Gra 0.05，0.5 和 0.5 mg·kg－1组和单独Rol组小鼠的逃避潜伏期、穿越原平台次数及原平台象限探索时间比率无统计学差异，提示Gra不影响Rol提高空间学习记忆功能的能力。本课题组前期的研究中发现，无论是在正常动物还是认知障碍动物模型上，Rol均可显著改善认知、增强记忆。采用基因敲除手段确认了PDE4D亚型是与学习记忆关系较密切的一个亚型。此外，用RNA干扰技术证明，PDE4D4/5亚型参与阿尔茨海默病的记忆调节，下调PDE4的两种亚亚型PDE4D4/5基因表达缓解淀粉样β蛋白造成的空间记忆损伤，这两种亚型可能在海马依赖型记忆形成和巩固中起重要作用。Rol目前改善学习记忆的功能逐渐受到普遍认可，常用作阳性对照药或工具药［12－13］。

本实验从药效学上初步探讨了Rol联合Gra用药的效果，结果显示Gra能够减少Rol所致的恶心呕吐不良反应，与此同时并不影响Rol的抗抑郁、增强学习记忆能力的效应。但是还有诸多问题亟待解决，例如抗抑郁作用还需要慢性长期考察，联合用药后新的不良反应、给药剂量和配伍，两药相互作用规律，两药药代动力学差异，剂型设计等，有望在进一步的实验研究中明确Gra联合Rol治疗抑郁症、改善学习记忆的应用前景。

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