蛛网膜下隙注射胶质细胞源性神经营养因子抑制脊神经结扎大鼠脊髓背角胶质原纤维酸性蛋白表达

郭建荣，贾东林，金宝伟，廉姜芳，袁晓红，沈华春

(1.宁波大学医学院附属李惠利医院麻醉科，浙江宁波 315040;2.北京大学第三医院麻醉科，北京 100191;3.宁波市器官移植研究重点实验室，浙江宁波 315040)

神经病理性疼痛是一种严重影响人类健康的疾病，甚至可导致患者最终失去行动能力，全世界患者达数百万人，是神经科学研究的一个重要课题。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)是从大鼠胶质细胞系B49的无血清培养液中分离纯化得到的一种新型神经营养因子。近来动物实验研究显示，GDNF通过靶细胞的逆向轴突运输调节脊髓神经细胞的代谢及功能，对神经元C纤维的中枢轴突具有营养支持作用，抑制其退变，使之保持正常的突触联系。对损伤所继发的细胞变性有促进恢复效应，与神经病理性疼痛关系密切［1－4］。有关疼痛调控的中枢机制研究是当今疼痛研究领域的热点，但无论从电生理方面，还是从组织学、细胞或分子水平，目前大多均局限于神经元的研究。近年来对星形胶质细胞的研究表明［5－7］，其细胞膜上存在着许多离子通道和神经递质的受体，能够产生和释放多种神经活性物质，在慢性疼痛的形成和发展中起着重要的作用。胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是中枢神经系统中星形胶质细胞的特征性标志物。前期研究结果表明，鞘内注射GDNF可减轻大鼠神经病理性疼痛［8－9］。但鞘内注射 GDNF 能否抑制GFAP蛋白的表达尚待探讨。本研究观察脊神经结扎(spinal nerve ligation，SNL)大鼠脊髓背角 GFAP蛋白表达的变化以及蛛网膜下隙给予GDNF对其影响，探讨GDNF减轻大鼠神经病理性疼痛的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和药品

GDNF(英国Pepro Tech Inc公司)，抗GFAP多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，SABC免疫组化检测试剂盒(武汉博士德公司)，羊抗大鼠GFAP多克隆抗体(Santa Cruz公司)。

1.2 动物、模型制备与分组

健康纯种Sprague-Dawley(SD)大鼠，6周龄，雄性，体质量180～200 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号:SCXK(京)2007-2008，饲养于铺垫锯末塑料盒内，每笼5只饲养，自然照明，自由饮水摄食。大鼠神经病理性疼痛模型的制备以及蛛网膜下腔置管按照文献［10］进行。大鼠ip给予1%戊巴比妥40 mg·kg－1麻醉后，置于俯卧位，背部切开皮肤，钝性分离左侧椎旁肌肉，暴露第5腰脊神经(L5)，并用6号丝线紧紧结扎，然后在骶骨角处分离出第6腰脊神经(L6)并结扎。止血、缝合并注射青霉素预防感染。假手术大鼠操作与手术大鼠相同，但只暴露脊神经，并不结扎。手术操作均由同一组人完成，以保证一致性。SD雄性大鼠随机分为4组，每组30只:正常对照组，假手术组，SNL模型组和GDNF 2 μg组。GDNF组脊神经结扎后隔日一次性蛛网膜下隙注射 10 μl GDNF 2 g·L－1。每组分别于术后第3天，第7天和第14天，进行行为学评估后处死大鼠，每组10只。取其脊髓组织用于免疫组织化学检查和Western印迹测定。

1.3 免疫组化法检测胶质原纤维酸性蛋白表达

将所取各组腰膨大段常规制成石蜡块，切片厚为5 μm。脊髓切片经二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水、灭活内源性过氧化氢酶、封闭，加入GFAP多克隆抗体，4℃过夜后，依次加入生物素标记的二抗、辣根过氧化物酶标记链酶卵白素，之后3，3'-联苯二胺(DAB)显色，乙醇脱水，二甲苯透明，封片后显微镜下照相。为确认免疫组化染色的特异性，以PBS代替一抗溶液作为阴性对照，其余染色步骤(包括滴加二抗溶液)完全相同。阳性对照为已知GFAP蛋白染色阳性标本切片。采用病理图像分析仪，胞浆和(或)胞核有棕黄色颗粒为阳性信号，每例切片分别取3个高倍视野(×400)，选用同批染色切片在全自动医学彩色图像分析系统软件下测定阳性信号。GFAP阳性细胞表达以灰度值来表示，采用图像分析软件对图像进行分析，阳性产物的面积占图像框总面积的相对面积称灰度值，在灰度阈值相同的条件下，灰度值与阳性细胞反应为正比关系。每一切片测量3个视野，求其平均值。

1.4 Western印迹法测定胶质原纤维酸性蛋白表达

将所取各组脊髓背角先放入预冷的匀浆液中，低温匀浆，离心取上清。绘制标准蛋白曲线，以考马斯亮蓝法测定样本蛋白浓度，加入1/3体积的4倍样本缓冲液95℃变性5 min。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸纤维素膜电转，用考马斯亮蓝对凝胶进行染色。与兔抗GFAP蛋白一抗(1∶400)4℃孵育杂交过夜，加入二抗，室温振荡孵育1.5 h，用NBT/BCIP检测反应条带，半定量分析。影像分析仪进行图像分析，以β肌动蛋白为内标，以各组的积分吸光度值(integrated absorance，IA)与β肌动蛋白的IA的比值表示GFAP蛋白表达水平。

2 结果

2.1 GDNF对GFAP表达的影响

2.1.1 免疫组化

免疫组化染色结果显示，GFAP存在于星形胶质细胞胞浆和突起中，其构成脊髓星形胶质细胞组织的一部分。GFAP阳性表达免疫产物为棕黄色颗粒，凡胞浆、细胞突起呈现棕黄色着色的胶质细胞为阳性反应。正常对照组和假手术组脊髓背角中可见少量淡染的棕黄色GFAP阳性细胞，零散分布，细胞排列整齐，胞体形态稍不规则，体积较小，有多个短至中等长度的突起。SNL组在术后第3天、第7天和第14天脊髓GFAP阳性细胞数目明显增加，染色显著加深，胞体增大，突起增粗，可持续至本实验观察到的第14天，而正常对照组与假手术组的星形胶质细胞未发生此种改变。GDNF组的阳性细胞显著减少，染色较浅，突起短细(图1，表1)。

图1 胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对脊神经结扎(SNL)大鼠脊髓背角胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达影响的典型免疫组化表现.采用结扎大鼠第5～第6腰脊神经(L5～L6)制备SNL模型。GDNF组于模型制备成功后隔日一次性蛛网膜下隙注射10 μl GDNF 2 g·L－1.假手术组给予生理盐水10 μl.分别于第3天、第5天和第7天麻醉大鼠，取L5～L6脊髓制备样品.A:正常对照组;B:假手术组;C:SNL模型组;D:模型+GDNF组.SNL组有大量激活的星型胶质细胞(箭头示);GFAP阳性细胞轮廓清晰，星状突起纤细(箭头示)，GFAP分布于胞浆及星状突(箭头示).Fig.1 Effect of glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)on glial fibrillary acidic protein(GFAP)expression at spinal dorsal horn of spinal nerve ligation(SNL)rats by immunohistochemistry assay.

表1 GDNF对SNL大鼠脊髓背角GFAP表达的影响Tab.1 Effect of GDNF on GFAP expression in SNL rats

2.1.2 Western 印迹

Western印迹检测结果显示，正常对照组和假手术组脊髓背角均出现GFAP免疫阳性条带，灰度值较低;SNL可诱导脊髓背角GFAP蛋白的表达，随着时间的延长，GFAP蛋白的灰度值逐渐升高;与SNL组比较，GDNF可显著降低GFAP的表达水平(P＜0.01)(图2，表2)。

图2 Western印迹法测定GDNF对SNL大鼠脊髓背角GFAP表达的影响.动物分组给药见图1.A，B，C分别为第3天，第7天，第14天;条带1～4分别为正常对照组，假手术组和SNL模型组和模型+GDNF组.Fig.2 Effect of GDNF on GFAP expression in the spinal dorsal horn of SNL rats by Western blotting.

表2 GDNF对SNL大鼠脊髓背角GFAP表达的影响Tab.2 Effect of GDNF on GFAP expression in the spinal dorsal horn of SNL rats by Western blotting

3 讨论

近来研究证实，神经胶质细胞参与慢性病理性疼痛的发生和维持。在各种不同的病理性疼痛动物模型中，如在甲醛炎性疼痛模型和脊神经结扎神经病理性疼痛模型中均发现神经胶质细胞被激活［11－12］。用药物抑制神经胶质细胞的激活能阻止病理性疼痛的发展［13］。疼痛过程中所累及的神经胶质细胞主要是小胶质细胞和星形胶质细胞［14］。神经胶质细胞的激活是产生疼痛扩大状态的必要条件［15］。胶质细胞主导的神经炎症和神经免疫反应在神经病理性疼痛的发生、维持中发挥重要作用。

GFAP是中枢神经系统中星形胶质细胞的特征性标志物。当机体受到某种刺激时，中枢神经系统某些部位的星形胶质细胞出现GFAP的阳性表达，表明星形胶质细胞对此刺激产生反应，反映出星形胶质细胞在此时的活性增强。在病理性神经疼痛发生过程中，星形胶质细胞被激活，GFAP大量增多，小胶质细胞也被激活，说明痛觉过敏的产生和疼痛持续状态有密切关系［7］。提示脊髓星形胶质细胞被激活可能参与了外周神经结扎所致疼痛的病理过程［16］。星形胶质细胞一旦激活，可释放多种神经活性物质，包括白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)，IL-6，兴奋性氨基酸，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)，一氧化氮，前列腺素，活性氧，ATP和神经生长因子等［14］。这些物质通过提高初级传入神经P物质、兴奋性氨基酸的释放量和增加产生疼痛物质神经元的兴奋性来调节疼痛。激活的星形胶质细胞释放的IL-1，IL-6和TNF-α在星形胶质细胞和神经元上都有其相应的受体，直接作用于神经元表面受体，或作用于其他免疫细胞，调节炎性因子的合成和释放［17］，这些物质具有自分泌和旁分泌功能，形成正反馈回路，不断加重痛觉过敏。另外，活化的胶质细胞还可影响神经元的可塑性［18］。

脊髓是传递从外周到大脑疼痛信息的中转站，传递疼痛的初级传入神经元轴突末梢终止于脊髓背角，在此与不同类型的脊髓次级神经元进行联系。其中有髓鞘Aδ纤维和无髓鞘C纤维终止于脊髓背角浅层［19］，这两种纤维均介导伤害性信息的传递。因此，脊髓背角浅层是和疼痛传导相关的重要部位。

本研究结果表明，对照组和假手术组大鼠脊髓背角神经细胞胞质和胞核仅有少量GFAP蛋白表达，SNL组大鼠L5～L6脊髓背角GFAP蛋白表达水平明显升高，比假手术组大鼠脊髓背角细胞胞质和胞核GFAP蛋白表达增多，术后第3天明显增加，第14天达到高峰，与其痛觉超敏时间相一致［8］。而与SNL组相比，GDNF组大鼠脊髓中GFAP蛋白表达显著降低，提示SNL后脊髓背角GFAP蛋白表达的增加与SNL后的神经病理性改变有关，说明调节机体神经病理性疼痛的信息接收、整合、传递与大脑皮质中神经元及星形胶质细胞功能有关，即星形胶质细胞参与SNL后的神经病理性疼痛的形成和发展。而鞘内给予GDNF可显著降低GFAP蛋白的表达，提示GDNF的镇痛作用机制与抑制星形胶质细胞活化有关。

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