雌激素预处理增强肝缺血再灌注损伤大鼠雌激素受体表达

胡礼宏，韩新生，郭建荣

(1.宁波大学医学院附属李惠利医院麻醉科，浙江宁波 315040;2.西安交通大学医学院附属第二医院麻醉科，陕西西安 710004)

研究显示雌激素对心、脑等器官的缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，I/R)均具有保护作用。其机制涉及雌激素抑制核因子κB(NF－κB)表达，促进还原型氧化氮合酶表达，减轻细胞凋亡，抗自由基，抗氧化等等［1－2］。近来研究发现，肝I/R后雌性动物的存活率明显要高于雄性动物，并发现雌激素对肝I/R损伤具有保护作用，可能是通过降低血清肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)水平，抑制肝组织NF－κB表达来实现的［3－5］。研究发现，肝中存在雌激素受体(estrogen receptor，ER)，但是未见有关ER在肝I/R损伤中相关作用的报道。本研究拟用雄性大鼠肝I/R损伤模型观察雌激素预处理后ER的表达情况。

1 材料与方法

1.1 试剂

17－β－雌二醇(17－beta－estrogen)，批号:20080150，购自美国Sigma公司;TNF－α试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司，NF－κB p65、ERα 试剂盒、DAB和SABC试剂盒购自武汉博士德公司。

1.2 动物及模型制备

1.3 动物分组

90只大鼠随机分成3组，每组30只。假手术组仅行麻醉、开腹、分离肝门、关腹，术前1 h大鼠ip给予等量生理盐水。I/R组，肝缺血前1 h大鼠ip给予等量生理盐水;雌激素预处理+I/R组，在肝缺血前1 h大鼠ip给予雌二醇4 mg·kg－1。分别于肝缺血前(R0)、再灌注1 h(R1)，R3，R6和R24时间点进行标本检测，每个时间点6只大鼠。

1.4 血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)及TNF-α水平检测和肝组织形态观察

分别在各时间点沿着大鼠剑突剪开胸腔，暴露心脏，右心室取4 ml血液，分装于Eppendorf导管中，室温下 1000×g离心 10 min分离出血清，－20℃保存待测。用全自动生化检测仪检测血清ALT水平，ELISA法测定血清TNF－α水平。同时取肝左中叶组织，用冰生理盐水冲洗后用10%甲醛溶液浸泡固定，制作石蜡切片，观察肝组织形态学变化。

1.5 SABC法检测肝组织NF-κB和ERα的表达

切片行多聚赖氨酸处理，采用SABC法检测肝组织NF－κB和ERα的表达情况。400倍显微镜下，细胞膜、细胞核和(或)细胞浆呈棕色视为阳性肝细胞。每张切片随机计数10个视野，观察阳性肝细胞数和总细胞数，计算阳性率(%)=阳性肝细胞数/总细胞数×100%。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 雌激素预处理对肝缺血再灌注损伤大鼠血清ALT及TNF-α水平的影响

表1及表2结果显示，肝I/R后，血清ALT及TNF－α水平明显升高。I/R后各个时间点，I/R和雌二醇+I/R组ALT及TNF－α水平明显高于缺血前，随着再灌注时间延长逐渐上升，于再灌注6 h达到高峰，到再灌注24 h时已显著下降。与假手术组相比，再灌注6 h时，I/R和雌二醇+I/R组ALT水平分别升高了11.7 倍和8.1 倍(P ＜0.01)，TNF－α 水平分别升高了5.2倍和3.2倍(P ＜0.01)。组间同时间点比较，雌二醇+I/R组明显低于I/R组(P＜0.05)。假手术组缺血前后各时间点的血清ALT及TNF－α水平无明显变化。

2.2 雌激素预处理对肝缺血再灌注损伤大鼠肝组织形态的影响

镜下可见假手术组各时间点肝组织变化无显著性差异。缺血前，假手术组、I/R组和雌二醇+I/R组无明显损伤。假手术组再灌6 h肝组织无改变(图1A)，I/R组再灌注后，可见逐渐增多的肝细胞水肿和脂肪变性(图1B);再灌注6 h时除可见增多的细胞水肿外，还可见点状细胞坏死和嗜酸性变性;再灌注24 h时仍可见细胞水肿和脂肪变性(照片未提供)，但点状细胞坏死和嗜酸性变性较再灌注6 h时有所减轻;雌二醇+I/R组再灌6 h变化趋势同I/R组(图1C)，但各时间点的损伤程度明显轻于I/R组，未见点状坏死(照片未提供)。

表1 雌激素预处理对大鼠肝缺血再灌注(I/R)损伤血清谷丙转氨酶(ALT)水平的影响Tab.1 Effect of estrogen pretreatment on alanine aminotransferase(ALT)levels in rats with hepatic ischemia/reperfusion(I/R)injury

表2 雌激素预处理对肝I/R损伤大鼠血清肿瘤坏死因子(TNF-α)水平的影响Tab.2 Effect of estrogen pretreatment on TNF-α levels in rats with hepatic I/R injury

图1 雌激素预处理对肝I/R损伤大鼠肝组织形态变化(HE×400).A:假手术组再灌注6 h;B:I/R组再灌注6 h肝组织;C:雌二醇+I/R组再灌注6 h肝组织.Fig.1 Effect of estrogen pretreatment on the change of tissue in rats with hepatic I/R injury(HE ×400).

2.3 雌激素预处理对肝缺血再灌注损伤大鼠肝组织NF-κB表达的影响

表3及图2结果显示，在各组肝组织中均可见NF－κB不同程度的表达。假手术组各时间点NF－κB表达无显著性差异。在I/R组和雌二醇+I/R组随着再灌注时间的延长NF－κB表达程度越高，再灌注6 h最高，到再灌注24 h时已显著下降;与假手术组相比，再灌注6 h时I/R组和雌二醇+I/R组NF－κB表达分别升高了8.6倍和4.8倍(P＜0.01);再灌注后同时间点比较，I/R组NF－κB的表达明显高于EI/R组(P＜0.05)，两组的表达水平明显高于假手术组(P ＜0.01)。

2.4 雌激素预处理后肝缺血再灌注损伤大鼠肝组织ERα表达的影响

显微镜下可见，各组肝细胞膜、细胞浆和细胞核均可见ERα不同程度的表达。假手术组各时间点肝组织ERα表达水平无显著性差异。I/R组和雌二醇+I/R组，随再灌注时间的延长肝组织ERα表达程度明显增强，至再灌注6 h时表达水平达高峰，至再灌注24 h时表达水平有所降低(P＜0.01);再灌注6 h时I/R组和雌二醇+I/R组ERα表达水平分别升高了4.2倍和7.4倍;但组间各时间点比较，雌二醇+I/R组的ERα表达水平明显高于I/R组(P ＜0.05)(表4，图3)。

表3 雌激素预处理对I/R大鼠肝组织NF-κB p65表达的影响Tab.3 Effect of estrogen pretreatment on NF-κB p65 levels in rats with hepatic I/R injury

图2 雌激素预处理对肝I/R损伤大鼠肝组织NF-κB p65表达的影响(ABC×400).分组处理见表1.A:假手术组再灌注6 h;B:I/R组再灌注6 h;C:雌二醇+I/R组再灌注6 h.图中棕色颗粒为NF－κB p65表达.Fig.2 Effect of estrogen pretreatment on NF-κB p65 in rats with hepatic I/R injury(ABC ×400).

表4 雌激素预处理对肝I/R损伤大鼠肝组织雌激素受体α(ERα)表达的影响Tab.4 Effect of estrogen pretreatment on estrogen receptorα(ERα)levels in rats with hepatic I/R injury

图3 雌激素预处理对肝I/R损伤大鼠肝组织雌激素受体α(ERα)表达的影响 (ABC×400).A:假手术组再灌注6 h肝组织ERα表达;B:I/R组再灌注6 h肝组织ERα表达;C:雌二醇+I/R组再灌注6 h.图中棕色颗粒为ERα阳性表达.Fig.3 Effect of estrogen pretreatment on nuclear estrogen receptor α(ERα)levels in rats with hepatic I/R injury(ABC ×400).

3 讨论

肝I/R损伤在临床上比较常见，如肝肿瘤切除、肝移植、休克等等，是导致肝功能衰竭的重要原因，也是目前研究的热点问题。研究认为，肝I/R损伤的发生机制可能与肝无氧代谢，Ca2+超载，氧自由基损伤，线粒体受损，微循环功能障碍，各种细胞因子作用，Kupffer细胞和中性粒细胞活化、NF－κB的激活以及细胞凋亡等有关。

有研究报道，雌激素对脑、心等脏器I/R损伤具有保护作用［1－2］。Harada 等［3］研究发现，肝 I/R 损伤后雌鼠的存活率明显高于雄鼠，而且用雌二醇治疗的雄鼠肝细胞损害程度显著轻于对照组，提示雌激素对肝I/R损伤有保护作用。本研究结果显示，用雌激素预处理后，血清AST水平明显下降，肝细胞损伤程度明显减轻，这与已有的研究结论基本一致［4－5］。

ER是核受体超家族成员之一，主要位于胞浆和胞核内，具有转录因子的作用［7－10］。研究发现，细胞膜上也存在ER，介导非基因组信号途径［11－13］。ER主要分为ERα和ERβ两种亚型，肝细胞上存在ER，分布于细胞膜、细胞浆和细胞核，且主要以α亚型为主［14－15］。雌激素与ER结合后通过基因组和非基因效应发挥作用。故本实验通过研究α亚型来反映ER的表达情况。结果显示，肝细胞膜、细胞浆和细胞核上存在ER。肝I/R后肝组织ER表达升高，而雌激素预处理组ER的表达显著高于I/R组，肝损伤程度也明显减轻，说明雌激素预处理后刺激ER的高表达，能够减轻肝I/R损伤。

促炎症细胞因子TNF－α在肝ER损伤过程中起到重要作用如触发细胞凋亡，直接导致肝窦内皮细胞肿胀，导致肝微循环障碍;激活中性粒细胞释放氧自由基;刺激单核巨噬细胞和其他细胞分泌白细胞介素1(interleukin－1，IL－1)，IL－6 等炎性因子。在本研究中，I/R组血浆TNF－α水平明显升高，而雌二醇+I/R组TNF－α活性明显低于I/R组。由此说明雌激素预处理后ER的高表达可以显著降低肝I/R导致的TNF－α升高。

肝I/R可引起缺血缺氧、氧化应激、Ca2+超载，中性粒细胞释放多种蛋白酶以及活性氧，Kupffer细胞活化等多种途径激活 NF－κB，NF－κB 激活后通过调节一系列基因的表达，如释放前炎症细胞因子TNF－α、IL－1、IL－6、细胞黏附分子－1、选择素等直接或间接地参与肝I/R损伤［16－17］。本研究结果显示，肝I/R后，肝组织NF－κB表达明显升高，雌激素预处理组明显低于I/R组，肝损伤也明显减轻，ER表达增加，说明ER的高表达与抑制NF－κB的表达和其下游的炎症细胞因子有关，进而减轻肝I/R损伤。

综上所述，雌激素预处理能刺激并增强ER的表达，进而减轻肝I/R损伤，其机制可能与抑制了NF－κB的表达和降低血清TNF－α水平有关。

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