顺序转化法进行酵母双杂交筛选相互作用蛋白质

吴怡，王岚，刘兰，韩清

(1.沈阳医学院基础医学院病原生物学教研室，辽宁 沈阳 110034;2.解放军95979部队卫生教研室)

PAK4(P21-activated kinase 4)是参与肿瘤发生、发展的一个重要蛋白质。目前，很多学者相继报道了一些与PAK4相互作用的靶蛋白，表明其在肿瘤进展中存在特有的作用方式。而酵母双杂交是一种高通量的蛋白质相互作用筛选方法，顺序转化法是将研究的目的蛋白相继转化到酵母菌中进行筛选，此方法阳性率比较高，而且结果可信度比较高。本研究旨在利用酵母双杂交的方法，从人胎脑cDNA文库中筛选PAK4相互作用蛋白，进一步了解其生物学特性和功能。

1 材料与方法

1.1 主要材料 大肠杆菌DH5α感受态细胞自备。酵母菌 AH109，载体 pGBKT7，人胎脑MATCHMAKER cDNA文库均购自Clontech公司。x-α-gal试剂，酵母YPDA培养基的蛋白胨，SD全氨基酸培养基、DO/-Trp、DO/-Leu、DO/-Trp/-Leu、 DO/-Trp/-Leu/-His、 DO/-Trp/-Leu/-His/-Ade氨基酸缺陷培养基分别购于Clontech公司，BBI公司，BD公司。DNA序列测定及两对引物的合成由Invitrogen生物技术公司完成。设计的两对引物序列见表1。

表1 扩增PAK4KD所用引物序列

1.2 实验方法

1.2.1 PAK4KD/pGBKT7质粒的构建 根据pGBKT7质粒多克隆位点和PAK4基因的酶切分析，选用了 Nde I和 BamH I作为克隆位点，再从PAK4KD基因的阅读框架序列的两端分别设计含Nde I和BamH I酶切位点的引物。以PAK4基因全长为模板，进行PCR扩增，反应条件为:95℃变性5 min后，94℃ 50 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，循环30次，最后于72℃延伸10 min。反应终止后，1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳后，试剂盒分别回收约800 bp PAK4KD的PCR产物。用Nde I和BamH I对PAK4KD PCR纯化产物及pGBKT7分别进行酶切。纯化后以T4 DNA连接酶于常温连接2 h，4℃过夜。大肠杆菌转化感受态细胞后，37℃培养过夜扩增，制备质粒DNA。用碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定并测序。

1.2.2 Western blot证实酵母蛋白表达 将转染的AH109酵母菌30℃过夜培养，次日扩增4 h(OD600达 0.4～0.6)，菌液中加入 Complete Cracking buffer、玻璃珠提取酵母蛋白。将其经10%十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodium dodecylsulfonate-polyacrylate gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离，40 V电压转印至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride membrane，PVDF)膜上，4℃过夜，用5%的脱脂奶粉封闭PVDF膜3 h，TBST(Tris Buffered Saline with Tween 20)清洗3次 (15 min/次)。将此膜加入抗 C-myc抗体(1∶500)室温3 h，TBST清洗2次 (15 min/次);辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗(1∶5 000)，室温下轻摇2 h，电化学发光 (electrochemiluminescence，ECL)显色，压片。

1.2.3 顺序转化法筛选胎脑文库相互作用阳性克隆 将已转入PAK4KD的AH109酵母菌30℃过夜培养 (OD600＞1.5)，次日扩增3 h［OD600达到 (0.5±0.1)］。按照Clontech说明书上提供的小剂量PEG/LiAc酵母转化的方法，将胎脑文库顺转到已转入pGBKT7-PAK4KD的AH109菌种中。将转化后的AH109酵母菌涂于SD/-Trp/-Leu+3-AT(25mM)平板上，30℃倒置培养3～4 d。用SD/-Trp/-Leu液体培养基将SD/-Trp/-Leu板培养基上生长的菌落冲下来，然后稀释1 000倍，涂于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上，30℃倒置培养6～8 d。挑取生长良好的菌落接种于 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/x-α-gal平板上，2～3 d后，筛选蓝色阳性菌落。

1.2.4 阳性克隆的序列分析 将阳性单克隆酵母菌落提取质粒，电转至大肠杆菌感受态细胞中，37℃培养过夜扩增，碱变性法提取细菌质粒DNA分别用BglⅡ和HaeⅢ酶切鉴定、测序。阳性克隆AD-Y质粒从两端测序，所得的序列与NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库作BLAST比较分析。

2 结果

2.1 PAK4KD/pGBKT7重组质粒的构建及鉴定 PAK4KD是将PAK4的325～579氨基酸构建到pGBKT7的载体中。将PAK4KD/pGBKT7重组质粒用Nde I和BamH I双酶切后，得到约762 bp及7 300 bp左右的两条带，与预期结果相符 (图1)，并经测序鉴定正确。

图1 重组质粒pGBKT7-PAK4KD酶切鉴定结果M:Lambda DNA/EcoRⅠ+HindⅢMarker;1:Nde I/BamHⅠ消化pGBKT7-PAK4KD

2.2 Western blot证实酵母蛋白表达结果 提取转化了pGBKT7空载体和pGBKT7-PAK4KD质粒的AH109酵母总蛋白，进行Western blot检测。1提取AH109酵母蛋白，为阴性对照;2提取转化了pGBKT7空载体的AH109酵母蛋白，载体在酵母中表达myc蛋白，为阳性对照;3提取转化pGBKT7-PAK4KD质粒的AH109酵母蛋白，用抗C-myc抗体进行Western blot鉴定PAK4KD-myc蛋白，证实了融合蛋白的表达 (52 KD)，结果见图2。

图2 诱饵蛋白在酵母中的表达1:阴性对照;2:阳性对照;3:PAK4KD-myc融合蛋白

2.3 顺序转化法筛选胎脑文库的相互作用的阳性克隆 以PAK4KD为诱饵蛋白，从人胎脑文库筛选PAK4相互作用蛋白，以下是在SD缺陷的平板上生长的情况。见图3。

图3 顺序转染法从文库筛选PAK4KD相互作用蛋白结果注:在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/x-α-gal生长变蓝的菌为His+和LacZ+阳性转化子

2.4 阳性克隆的鉴定 挑取His+和LacZ+阳性酵母转化子，提取酵母质粒电转入大肠杆菌，碱裂解法提取质粒，BglⅡ酶切鉴定文库插入片断大小(图4)。图中所示8 000 bp附近的条带为文库载体pGADT7位置，在该载体多克隆位点的两端各有一个BglⅡ酶切位点，人胎脑文库就构建在这个酶切位点中。阳性转化子的质粒用BglⅡ进行酶切，切出不同大小片断外源插入的文库基因。

图4 Bg1Ⅱ酶切鉴定不同克隆M1:lambda EcoRⅠ+HindⅢMarker;M2:DL 2000;1～9:BglⅡ酶切鉴定阳性克隆

3 讨论

PAK(P21-activated kinase)家族磷酸化下游底物丝氨酸/苏氨酸残基，参与许多重要生物学活性调节，如细胞骨架的调节、细胞凋亡、细胞周期、血管生成及基因转录调控等，特别是在肿瘤的发生、侵袭、转移中，PAK有着重要的生物学作用。

PAK4是Ⅱ类PAKs中发现最早，也是目前研究比较多的Ⅱ类 PAK［1］。PAK4结合并磷酸化slingshot，使slingshot/LIMK1复合体中的LIMK1去磷酸化，刺激肌动蛋白骨架重组［2］;磷酸化Rho家族鸟嘌呤核苷交换因子GEF-H1的Ser810位点阻断GEF-H1依赖的应力纤维生成，促进细胞片状伪足的形成［3］;PAK4的C-末端激酶区与整合蛋白αvβ5相互作用调节细胞迁移和肿瘤细胞的分化［4］。PAK4可激活 JNK，p38 MAPK 通路，而MAP kinase kinase 6(p38 MAPK上游的激活子)可激活 PAK4，参与细胞对应激信号的反应［5］。PAK4的C-末端与 PRG(PDZ RhoGEF)C-末端相互作用，抑制Rho家族小鸟苷三磷酸酶 (Rho GTPase)的活性。另外，肝细胞生长因子 (human growth factor，HGF)与肿瘤的发展、侵袭和转移相关，可活化上皮细胞PAK4并导致细胞应力纤维和粘着斑减少，细胞变圆，增加细胞的移动［6］。

根据 PAK4的结构特点，将 PAK4激酶域(PAK4KD)构建到 pGBKT7(含 TRP1基因、GAL4 DNA结合区)质粒中。利用顺序转化法从构建到pACT2质粒 (含LEU2基因和GAL4激活区)的人胎脑文库中筛选相互作用的蛋白质。经过氨基酸缺陷培养基的多次筛选，挑取阳性克隆提取质粒酶切验证后测序，得到了多个与PAK4相互作用蛋白质的序列，NCBI对测序结果分析它们与癌症转移、细胞胞吐过程、蛋白质泛素化等相关。这一结果为进一步研究PAK4的生物学功能提供了新的思路。

［1］ Yang F，Li X，Sharma M，et al.Androgen receptor specifically interacts with a novel p21-activated kinase，PAK6 ［J］.J Biol Chem，2001，296:15345－15353.

［2］ Soosairajah J.Interplay between components of a novel LIM kinase-slingshot phosphatase complex regulates cofilin ［J］.EMBO J，2005，24:473 －486.

［3］ Callow MG.PAK4mediatesmorphological changes through the regulation of GEF-H1 ［J］.JCell Sci，2005，18:1861.

［4］ Hongquan Z，Zhilun L.P21-activated kinase4 interactswith integrin alpha v beta 5 and regulates alpha v beta 5-mediated cell migration［J］.JCell Biol，2002，7:1287 －1297.

［5］ Kaur R.Activation of p21-activated kinase 6 by MAP kinase kinase 6 and p38 MAP kinase［J］.JBiol Chem，2005，280:3323－3330.

［6］ Wells CM.AK4 is activated via PI3K in HGF-stimulated epithelial cells［J］.JCell Sci，2002，115:3947 －3956.