α-淀粉酶发酵条件的优化

朱中南 郑 毅 章淑妹 朱志春

α-淀粉酶发酵条件的优化

朱中南 郑 毅*章淑妹 朱志春

福建师范大学生命科学学院

利用米曲霉菌株液体发酵生产α-淀粉酶。产酶培养基优化试验表明：以面粉为碳源，黄豆饼粉为有机氮源，NaNO3为无机氮源。发酵配方如下（g/L）：面粉浓度为45，黄豆饼粉浓度为20，NaNO34，K2HPO43，MgSO41，FeSO4•7H20 0.01。产酶培养条件优化表明：最适发酵初始pH为7，装液量为40mL（250mL三角瓶），接种量为10%，发酵温度为33.5℃，摇床转速为235rpm，培养时间为72h。此条件下，最终发酵水平达到1962.32U/mL，比初始时提高45%。

米曲霉 α-淀粉酶 单因素实验

α- 淀粉酶（α-1，4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶）普遍分布在动物、植物和微生物中，是一种重要的淀粉水解酶[1]。它以随机作用方式切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α-1，4葡萄糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一，主要应用于发酵、纺织、饲料、医药等多种领域[2]。应用于各种工业中对缩短生产周期、提高产品得率和原料的利用率，提高产品质量和节约粮食资源，都有着极其重要的作用。

目前本实验室的米曲霉是采用诱变融合得到，其发酵的初始培养基的配方，所产淀粉酶的量还不是很高，通过培养基的优化可以提高酶的产量，同时可以采用更为低廉的天然农产品或工、农业生产废弃品来替代价格较为昂贵的药品、材料，以降低成本。本实验采用单因素法确定米曲霉最适的碳源、氮源、无机盐、pH值、温度、接种量、装液量等，从而得出最优的培养基配方和发酵条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1菌种

米曲霉()FS0113,本实验室保藏。

1.1.2培养基

1）斜面培养基（g/L）：蔗糖 30，NaNO32, K2HPO41, MgSO40.05, KCl 0.5,麸皮 0.8，琼脂 1.2，FeSO4•7H20 0.01。

2）种子培养基（g/L)：NaNO34，K2HPO43，MgSO41，FeSO4•7H20 0.01，玉米粉 40，黄豆饼粉 16。

3）发酵初始培养基（g/L）：NaNO34，K2HPO43，MgSO41，FeSO4•7H20 0.01，玉米粉 40，黄豆饼粉 16。

1.2 实验方法

1.2.1酶活测定方法

Yoo改良法[2]：反应体系为5mL 0.5%淀粉+0.5mL酶，在pH6.0、40℃下反应5min后，加0.1mol/L H2SO45mL终止反应，取0.5mL反应液+5mL 0.4mmol/L I2-KI溶液显色，620nm下测光密度。1个活力单位定义为5min水解1mg淀粉的酶量。

酶活的计算方法：

酶活=（对照组-实验组）/对照组×淀粉浓度×酶液稀释倍数

1.2.2米曲霉最初发酵培养条件

在250mL三角瓶液体培养，装液量为40mL，接种量为4mL，在235rpm、28℃的条件下培养72h。

2 结果与分析

2.1 α-淀粉酶发酵培养基优化

2.1.1不同碳源对发酵产酶的影响

单独选择面粉、大米粉、糊精、淀粉、荞麦、高粱粉、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖作为碳源，替代基础发酵培养基中的玉米粉，其余培养基成分和发酵条件不变。测定酶活结果，由图1可见，面粉、大米粉、淀粉、荞麦作为碳源时，都有利于米曲霉产酶，而高粱粉、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖对产酶的促进作用较低。其中面粉对产酶的促进作用最大，因此选择面粉作为最佳唯一碳源。

2.1.2不同有机氮源对发酵产酶的影响

在以面粉为唯一的碳源的条件下，选择玉米浆、蛋白胨、酵母膏、尿素、牛肉膏代替黄豆饼粉作为有机氮源，其余条件不变。测定酶活结果由图2可看出，牛肉膏作为有机氮源有利于米曲霉产酶，而玉米浆、蛋白胨、酵母膏、尿素作为有机氮源时，对产酶的促进作用较低。从工业生产的角度，牛肉膏的成本太高，产酶促进作用只较黄豆饼粉作为有机氮源的高一些，因此选择黄豆饼粉作为有机氮源。

图1 不同碳源对产α-淀粉酶的影响

图2 不同有机氮源对产α-淀粉酶的影响

2.1.3不同无机氮源对发酵产酶的影响

在以面粉和黄豆饼粉的最佳浓度的条件下，选择NaNO3、NH4NO3、KNO3、NH4Cl、（NH4）2SO4作为附加无机氮源。由图3表明，NaNO3和KNO3对酶活的促进作用较大，而NH4NO、NH4Cl、（NH4）2SO4的促进作用较小。因此选择NaNO3作为最佳的无机氮源。

图3 不同无机氮源对产α-淀粉酶的影响

2.2 α- 淀粉酶发酵培养条件优化

2.2.1不同发酵初始pH值对发酵产酶的影响

通过以上实验，得出最佳的培养基成分，在基础上通过改变发酵液的pH值进行发酵。测定酶活由图4可以得到，当pH值为7，也就是发酵液为中性的情况下，其酶活最高，而偏酸性或者偏碱性都对酶活有一定的抑制作用，随酸度（碱度）的加强，抑制越明显。因此发酵过程选择pH值为7的条件进行发酵。

图4 pH对产α-淀粉酶的影响

2.2.2不同接种量对发酵产酶的影响

在最佳发酵配方的基础上，通过对1mL、3mL、4mL、5 mL、7mL、10mL的接种量进行发酵对比。测定酶活如图5所示，增加接种量，对米曲霉产酶能力的促进作用越大，在达到4mL接种量时，其促进作用最大，继续增加时，反而会使其产酶能力的促进作用降低。因此选择4mL的接种量作为最佳的接种量。

图5 接种量对产α-淀粉酶的影响

2.2.3不同装液量对发酵产酶的影响

通过对25mL、35mL、40mL、45mL、55mL、70mL的装液量进行发酵对比。测定酶活如图6所示，装液量的变化对于发酵的结果影响不是很大。只有在40mL和55mL装液量情况下对产酶的促进作用较大一些，出于经济角度考虑，选择40mL的装液量作为最适装液量。

图6 装液量对米曲霉产α-淀粉酶的影响

2.2.4 不同温度对发酵产酶的影响

以发酵的最佳配方配制培养基，分别在24.5℃、28℃、30℃、33.5℃、37℃、40.5℃、44℃下进行发酵。其结果由图7可得，温度升高，其产酶能力也随之提高，当到达33.5℃时产酶能力最高，继续升高温度，产酶能力降低，最后当温度到达44℃时，产酶能力为0。因此米曲霉的产α-淀粉酶的最适温度为33.5℃。

3 结论

通过以上优化，发酵前后培养基与培养条件比较见表1。

图7 温度对产α-淀粉酶的影响

表1 培养基优化前后α-淀粉酶产量对比

经过培养基与培养条件优化，得出最佳培养基配方（g/L）：面粉45，黄豆饼粉20，NaNO34，K2HPO43，MgSO41，FeSO4•7H20 0.01。最优培养条件为：初始培养基pH为7，40mL的装液量，4mL的接种量，温度为33.5℃、转数为235rpm。在上述发酵条件下，发酵72h后，测得最高酶活为1962.32 U/mL，而初始发酵的酶活为1365.68 U/mL，提高了45%。

[1] 罗志刚，杨景峰，罗发兴.α-淀粉酶的性质及应用α-淀粉酶的性质及应用[J].食品研究与开发，2007，28（8）：163-167.

[2] 王淑军，陆兆新,秦松，吕明生，李富超，刘红飞，邓祥元.超嗜热古菌耐热酸性α-淀粉酶的发酵件和酶学性质研究[J].海洋与湖沼，2009，40（1）：19-26.

[3] 安弋，刘新育，芦鹏，刘亮伟，陈红.1株酸性α-淀粉酶产生菌的鉴定及发酵条件优化[J]. 安徽农业科学，2010，38( 4) : 1709-1711.

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[5] 刘红飞，吕明生，王淑军，房耀维，李华钟.低温α-淀粉酶产生菌GS230发酵条件与酶学性质研究[J]. 中国酿造，2008，13（190）：13-18.

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