丹参溢心胶囊微生物检查法验证

田昭翠 韦继雯

云南省文山州食品药品检验所，云南 文山 663000

为探讨丹参溢心胶囊微生物限度，我们对该药品的微生物限度检查进行了细菌，霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法验证。

1 试验材料

1.1 试药与培养基

营养肉汤、营养琼脂、玫瑰红钠、改良马丁培养基PH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液 (均来源于中国生物制品检定所)氯化钠分析 (汕头市西陇化工有限公司)。

1.2 样品

丹参溢心胶囊，批号为2010021，20100418，20100719由云南文山特安呐制药有限公司生产，编号为1，2，3。

1.3 仪器

电热鼓风干燥箱 (型号:DG101—1A，北京市永光医疗仪器厂);隔水式电热恒温培养箱 (型号:PYX—34×40，上海市跃进医疗器械七厂);电子恒温水浴锅 (DZKW—4，上海科析试验仪器厂);电热手提式压力蒸汽消毒器 (型号:YXQ1280，上海医疗用核子仪器厂);电子恒温水浴锅 (DZKW—4，上海科析试验仪器厂)。

1.4 阳性对照菌

枯草芽胞杆菌 ［CMCC(B)63501］，大肠埃希菌［CMCC(B)44102］，金黄色葡萄球菌 ［CMCC(B)26003］，白色念珠菌 ［CMCC(F)98001］黑曲霉 ［CMCC(F)980003］。均由云南省食品药品检验所提供。

2 实验方法与结果

2.1 供试液的制备

分别取供试品10g，加入PH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液至100m1，45℃水浴15分钟混匀，制成1∶10的供试液，取2m1加入8m1PH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液混匀，制成1:50的供试液，取1m1加入9m1PH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液混匀，制成1∶100的供试液，备用。

2.2 菌液的制备

①取经36±1℃培养24h的大肠埃希菌，枯草芽胞杆菌，金黄色葡萄球菌的肉汤培养物1m1，用0.9%氯化钠溶液稀释到10－5－10－7。②取经26±1℃培养18－24h的白色念珠菌的改良马丁液体培养物1m1，用0.9%氯化钠溶液稀释到10－6。③接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23－28℃培养5－7天，加入3m1 0.9%氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出1m1，用0.9%氯化钠溶液10倍稀释到10－51m1。以上三种使成每1m1含50—100cfu，经活菌计数备用。

2.3 回收率测定

2.3.1 直接接种法 每组平行试验2份①试验组取供试液1m1，加入各菌液1m1，立即倾注相应的琼脂培养基;②菌液组取上述菌液1m1注入平皿后，立即倾注相应的琼脂培养基;③供试品对照组取供试品1m1，立即倾注相应的琼脂培养基;④取稀释液1m1注入平皿，立即倾注相应的琼脂培养基，作阴性对照。大肠埃希菌，枯草芽胞杆菌，金黄色葡萄球菌的平皿注入营养琼脂培养基，37℃培养48h，白色念珠菌和黑曲霉的平皿注入玫瑰红钠培养基，置25－27℃培养72h。结果见表1。

表1 直接接种法(取平均值个/m1)

2.3.2 培养基稀释法 平行试验2份。①试验组取1:10，1:50、1:100供试液1m1，分别注入5个平皿中，每皿0.2m1，加入枯草芽胞杆菌菌液1m1，立即倾注相应的琼脂培养基;②菌液组取菌液枯草芽胞杆菌1m1注入平皿后，立即倾注相应的琼脂培养基;③供试品对照组取供试品1m1，分别注入5个平皿中，每皿0.2m1，立即倾注相应的琼脂培养基;培养。结果见表2。

表2 培养基稀释法枯草芽胞杆 (取平均值个/m1)

2.4 回收率的计算方法

2.5 控制菌检查法验证

本品为口服制剂，按2005年药典标准检查控制菌是大肠埃希菌，平行试验2份。①供试液对照组:取1:10供试液10m1接种于100m1的胆盐乳糖增菌液;②试验组:按方法①再加入1m1相应的阳性对照菌，混匀;③阴性对照组:按①取样后，胆盐乳糖增菌液中加1m1金黄色葡萄球菌;④阳性对照组:取1m1大肠埃希菌加入100m1胆盐乳糖增菌液中。于36±1℃培养24h。取上述培养物0.2m1，加入含5m1MUG培养基的试管内，培养，用MUG培养基作对照，分别于5h和24h在360nm紫外线下观察，。沿管辟加入靛基质试液数滴，观察。试验结果:供试品对照组未检出大肠埃希菌，阳性对照组检出相应的阳性菌。阴性对照组未检出大肠埃希菌，结果表明可用常规法进行检查。

3 讨论

丹参溢心胶囊是由三七、紫丹参、灯盏细辛等组成，主要用于活血化瘀，具有一定的抑菌作用。从表1、2可见，样品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉回收率大于70﹪。证明其对上述4种菌无抑菌作用。枯草芽胞杆菌有抑菌作用，在1:10稀释级回收率均不过20﹪，1:50、1:100稀释级回收率均大于70﹪，故1:10稀释级应采用培养基稀释法测定该样品的微生物限度，在1:50、1:100稀释级可用常规方法测定。

根据上述结果，丹参溢心胶囊在生产工艺，组成成份及原检验条件不变时，微生物限度检查细菌数测定用培养基稀释法，霉菌和酵母菌数测定用直接法，控制菌用常规法测定。

［1］中国药典［S］.一部.2005:附录71—74.

［2］中国药品生物制品检定所.中国药品操作规范［M］.北京:中医药科技出版社，2005:335－341.

［3］杜鹃，范兵三.高茶的微生物限度检查方法验证研究［J］.中国药事，2006，20(3):156－158.

［4］陆蓓，凌明.栓剂的微生物限度检查方法的验证［J］.中国药事，2006，20(3):167－168.

［5］孙玲兰.双黄连口服液微生物限度检查法验证［J］.中国药师，2008，11(1):102－103.

［6］吴潇.乌洛托品溶液的微生物限度检查［J］.中国药师，2007，10(12):1261－1262.

［7］张雪原，林晓辉.三种医院制剂微生物限度检查法的建立［J］.中国药师，2008，11(8):1004－1006.

［8］张蓓.荷叶降脂胶囊微生物限度检查方法的验证［J］.中国药事，2010，24(10):1017－1018.

［9］林常定.依沙吖啶溶液的微生物限度检查法［J］.中国药师，2010，13(4):597－599.