树突状细胞在肿瘤免疫治疗中的应用与进展

朱传东 综述 郑 勤 张全安 审校

肿瘤免疫治疗的目的是针对特定的抗原激发体内的免疫应答来消除肿瘤细胞，提高肿瘤患者的生存率以及提高生活质量。树突状细胞(dendritic cells，DC)是目前已经知道最强的抗原递呈细胞。临床研究表明，DC免疫治疗诱导产生特定的抗原免疫应答对人体是安全的。DC在识别肿瘤细胞、刺激集体的免疫应答并同肿瘤细胞进行战斗方面的优点在免疫治疗上非常突出，可以清除化疗失败的恶性肿瘤甚至是肿瘤干细胞［1］，大多数的免疫治疗的体系都是通过DC来实现的［2，3］。因此，进行DC来源的肿瘤疫苗的研究对肿瘤的免疫治疗具有重要意义。我们主要讨论以DC为基础的DC相关疫苗及其对肿瘤疾病的治疗。

1 DC的细胞生物学特性

DC起源于多能造血干细胞，分为髓样DC和淋巴样DC 2种。DC在组织中含量极低，不足人外周血单个核细胞的1%。在组织中DC以未成熟的状态存在，在摄取抗原后开始逐步成熟。成熟DC高表达人类DC相对特征标志CDla、MHC分子(MHC-Ⅰ和 MHC-Ⅱ)、共刺激分子(CD80、CD86)、黏附分子(CD54、CD50)及淋巴细胞功能相关抗原(CD58)。当其受到刺激被激活或成熟时，MHC Ⅰ、MHCⅡ、CD80、CD86、CD40、ICAM21等免疫刺激分子和特异性抗原表达增加，抗原递呈功能明显增强，同时分泌一些重要的生物因子(如IL-12、TNF-α等)。此时DC向周围淋巴组织的T细胞依赖区迁移，激活初始型T细胞，发动特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫反应便具备了最初的免疫应答能力［4］。DC被认为是机体免疫应答的始动者，特别在抗肿瘤免疫中具有核心地位。未成熟DC抗原摄取能力强，但抗原提呈能力弱;成熟DC则相反。在外周淋巴器官，成熟DC表面的抗原肽-MHCⅡ类分子复合物和抗原肽-MHCⅠ类分子复合物分别被CD4、CD8T细胞表面的TCR识别，形成TCR-抗原肽-MHC分子三元体，在黏附分子及其刺激分子的作用下紧密结合，从而激活T淋巴细胞。髓样DC主要诱导Th0向Th1分化，淋巴样DC主要诱导Th0向Th2分化。

2 DC与肿瘤的关系

2.1 DC与肿瘤的发生及预后

研究表明，DC与肿瘤的发生发展有一定的关系。肿瘤组织及外周DC的数量减少和功能缺陷均可导致DC不能有效递呈肿瘤抗原、激活T淋巴细胞、诱导抗肿瘤免疫反应，致使肿瘤浸润、转移［5］。如果肿瘤患者体内DC功能缺陷，不能有效递呈抗原，则导致免疫无能或者免疫耐受，使得肿瘤发生发展［6］。有研究发现，肿瘤组织中DC数量与肿瘤的原发病灶、转移病灶、临床分期及周围浸润呈负相关。绝大多数实体肿瘤及其周围组织都有DC浸润，DC高度浸润伴肿瘤细胞高分化预后好;而肿瘤伴DC低浸润呈恶性进展状态。肿瘤患者体内易发生DC的自发性凋亡以及T细胞、肿瘤细胞介导的DC凋亡［7］。具体机制目前尚不清楚，有研究表明肿瘤细胞可能是通过分泌抑制性的细胞因子、神经节苷脂和Fas-FasL途径［8～10］来促使DC凋亡，导致肿瘤的发生。

2.2 DC与肿瘤的免疫逃避

肿瘤细胞的免疫逃逸机制较为复杂，主要原因在于其免疫原性和具有抗原调变能力，致使肿瘤抗原不能有效提呈，T细胞介导的免疫不能被有效激活，或因缺乏共刺激信号而导致T细胞失能。针对这两种机制，用肿瘤抗原致敏［11］或用基因修饰DC［12］甚至与肿瘤细胞融合［13］，使 DC高表达MHC Ⅰ和Ⅱ类分子提呈丰富的肿瘤抗原肽，使相应的T细胞受体被占据，同时DC提供高水平的协同刺激分子CD40/CD80/CD86等，充分激活T细胞增殖;还通过自分泌IFNA/IL6第二部分细胞因子的作用方式增强T细胞激发从而发挥抗肿瘤作用。除了产生强大的抗肿瘤免疫反应，DC可能也具有直接杀伤肿瘤的作用。研究发现DC可通过表达细胞死亡受体的配体，杀死肿瘤细胞［14］。

3 DC及DC疫苗的制备

3.1 DC 的制备

DC由CD34+或CD14+细胞中产生，存于人骨髓、脐血以及成年人外周血的CD34+细胞，体外在添加GM-CSF和TNF-a的培养条件下可以发育成熟DC;CD14+单核细胞在添加GMCSF和IL-4的条件下也可以成为成熟的DC，近期有研究发现LAK细胞也可以促进 DC细胞的成熟［15］。Babatz等［16］研究出了用免疫磁珠分选的方法制备CD14+细胞，从外周血分离出的单核细胞通过磁珠分选或者是plastic adherence的方法分离获得，进而添加 IL-4，GM-CSF，TNF-a，PGE2，IL-1B 等可使 CD14+分化成单核细胞。通过这种途径培养出来的DC被认为是不成熟的，它们具有高效的抗原摄取能力，同时还具备有限的刺激T细胞增殖的能力。为了提高他们的免疫原性，这些DC在正常情况下需要 TNF-a，CD40配体和单核细胞培养液的刺激［17］。这些激活的刺激信号诱导产生CD80、CD83、CD86的上调，促进亲炎症细胞因子IL-12，IL-15，TNF-α和 IL-6的分泌。PGE2刺激DC对于提高DC对MIP-3B的应答显得尤为有效。Mip-3b是1种吸引DC迁徙至淋巴结的细胞趋化因子。循环骨髓DC细胞通常是通过密度梯度离心方法分离的。这些APC抗原提呈细胞通过体内的FLT3配体扩增到数倍。

3.2 DC相关肿瘤疫苗的制备

目前DC疫苗主要有几大类:细胞性肿瘤抗原修饰的DC;肿瘤抗原肽修饰的DC;肿瘤抗原及细胞因子基因转染修饰的DC以及肿瘤细胞融合DC疫苗等。

3.2.1 细胞性肿瘤抗原修饰的DC 目前肿瘤特异性抗原或相关抗原得到明确鉴定的为数不多，因而予以瘤细胞全部抗原信息(如肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞提取物、肿瘤细胞的总RNA或经过灭活的完整的肿瘤细胞、肿瘤细胞与树突状细胞的融合)修饰DC成为最直接的1种方法。基于细胞性肿瘤抗原易于获取和制备，因而应用全细胞性肿瘤抗原冲击致敏DC的方法来制备DC疫苗是目前临床研究应用最广泛的方法之一［18～20］。目前主要用于肾癌、恶性黑色素瘤(恶黑)、前列腺癌和恶性胶质瘤等肿瘤的临床研究。

3.2.2 肿瘤抗原肽修饰的DC 肿瘤抗原肽 (包括合成肽)或肿瘤细胞相关抗原与自身或同种异体的DC共育，DC与肿瘤表位肽结合之后可激发抗肿瘤CTL效应，目前实验室和临床应用较多的抗原肽来源于众多肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)，包括人端粒酶逆转录酶(hTERT)，黑色素瘤抗原，癌胚抗原(CEA)，p53，Survivin，Her-2/Neu 等［21］。确定肿瘤表达的相关TAA后，整个TAA以蛋白的形式被输送到DC，表位抗原肽被递呈给个Ⅱ类和Ⅰ类HLA分子，诱导出针对不同抗原来源的表位肽CTL产生。用负载肿瘤表位肽的DC免疫小鼠，可使具有同表位肽的肿瘤消退及抵抗致死剂量肿瘤细胞的攻击。另外，应用肿瘤抗原MHC-Ⅰ类多肽冲击树突状细胞，可提高肿瘤抗原浓度及其靶向性。

3.2.3 基因修饰制备DC疫苗 肿瘤抗原编码基因、细胞因子基因或趋化因子基因导入DC可在期内持续表达肿瘤抗原，增强了MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ分子递呈抗原的能力。转染 RNA也可以高效的诱导特异性CTL细胞的免疫应答，体外研究已在多种肿瘤上证明其有效性。转染基因方法较多，逆转录病毒痘病毒介导的转染法效率较高，基因表达比较稳定，应用较为广泛。基因修饰的DC肿瘤疫苗既能引起高效率的CTL细胞的免疫应答，几乎没有副作用，是1种安全有效的免疫治疗方法［15］。

3.2.4 肿瘤细胞与DC融合疫苗 细胞融合技术最大的优点就在于融合细胞能呈递肿瘤细胞所有的抗原，包括已知的和未知的抗原。鉴于目前大多数人类肿瘤细胞抗原类型仍未得到明确的鉴定，用全肿瘤细胞作为疫苗仍不失为一类简单、有效的方法。最佳候选细胞为自身肿瘤细胞，DC可来源于肿瘤患者自身或者异体，融合技术目前以电融合的效率最高，通常比化学融合法提高1～2个数量级。

4 DC疫苗在肿瘤临床治疗中的应用

DC肿瘤疫苗是近年来肿瘤免疫治疗领域的热点，其基本原理是在体外诱导扩增DC，DC负载各种肿瘤相关抗原，形成疫苗回输，从而激活针对肿瘤细胞的CTL，使患者获得抗肿瘤的能力。目前，DC肿瘤疫苗正在被迅速、广泛地应用于动物试验和早期临床试验。无论是基础实验还是临床应用，树突状细胞的肿瘤疫苗在肿瘤的预防和治疗方面显示了较好的应用前景。

4.1 DC与恶性黑色素瘤

DC免疫治疗早期多集中于恶性黑色素瘤方面，目前取得一些可喜进展。Nagayama等［19］进行了一项DC疫苗联合IL-2治疗Ⅳ期恶性黑色素瘤的Ⅰ期临床研究，DC疫苗制备以自体肿瘤细胞裂解物刺激外周血单个核细胞，并在细胞因子GM-CSF、IL-4和TNF-a作用下诱导成熟，10例Ⅳ期恶性黑色素瘤患者接受免疫，1×107DC，每周1次，共进行10次，同时给予IL-2，剂量为350～700 kIU，每周3次，结果证实2例有效，1例SD;在针对恶性黑色素瘤的临床研究中，Hersey等［20，22］进行一项治疗Ⅳ恶性黑色素瘤的Ⅰ/Ⅱ期临床研究，以2种不同的方法制备DC疫苗，①以自体肿瘤细胞裂解物冲击;②MAGE-3.A2、酪氨酸激酶和gp100 3种抗原肽联合冲击或MART-1和KLH2种抗原肽联合冲击。33例患者接受治疗，19组接受肿瘤细胞裂解物冲击组治疗的患者中有4例有效，14例接受抗原肽联合冲击组治疗的患者中有9例表现出病情稳定。所有患者均容易耐受，无明显毒副作用。

4.2 DC与前列腺癌

DC相关疫苗在前列腺癌中的研究亦较为广泛。Pandha等［18］进行Ⅰ/Ⅱ期的临床研究中，11例激素治疗失败的前列腺癌患者和5例转移性肾癌患者接受DC疫苗治疗，结果证实该疗法安全可靠，所有的患者体内均可检测到Th1型细胞因子明显升高，有1例前列腺癌患者的PSA明显降低，2例肾癌患者评价为SD。Hallmeyer等［23］亦进行了一项以PSA多肽冲击DC制备疫苗治疗前列腺癌的临床研究，结果表明，28例受试者中有14例有检测到迟发型变态反应的发生，其中有11例表现出PSA的稳定或下降。另14例未检测到迟发型变态反应的患者中，有9例表现出PSA的升高。

4.3 DC 与肾癌

Gitlitz等［24］进行了一项以DC疫苗治疗转移肾癌的临床研究，DC疫苗通过自体肿瘤细胞裂解物冲击外周血CD14+单个核细胞诱导成熟的DC制备，10例患者接受免疫，结果有1例患者出现PR。而在Avigan等［25］进行的一项DC疫苗治疗转移性肾癌Ⅰ期临床研究中，通过自体肿瘤细胞与DC细胞融合制备疫苗，23例患者接受1×105至4 ×106融合细胞免疫，每3周1次，结果没有治疗相关不良反应的发生，分泌IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞的比例明显升高，其中5例肾癌患者病情稳定，提示该方法是肾癌的1种安全合理的疗法。

4.4 DC与其他肿瘤

Hirschowitz等［26］进行多项DC疫苗治疗非小细胞肺癌的临床研究，其抗原肽选择高表达Her2/neu、CEA、WT1、Mage2肺癌细胞株的凋亡小体，以其冲击成熟DC制备疫苗，治疗了16例ⅠA到ⅢB期的非小细胞肺癌患者。结果有5例患者可检测到肿瘤特异的细胞免疫，6例患者可检测到抗原特异的细胞免疫应答，5例患者无特异的细胞免疫产生。随着一些针对非小细胞肺癌的Ⅱ期随机临床试验研究的进行，DC疫苗在肺癌治疗中的作用进一步凸现了。众多关于DC肿瘤疫苗治疗肝癌、骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌及恶性淋巴瘤等研究均进入临床验证阶段，很多也取得令人鼓舞的结果，显示出DC疫苗在恶性肿瘤治疗中的巨大前景。

综上所述，DC参与恶性肿瘤的发生发展，无论是基础实验还是具体的临床应用，基于DC的肿瘤疫苗在恶性肿瘤的预防和治疗中显示了较好的应用前景，为恶性肿瘤的免疫治疗提供了新策略。但DC相关肿瘤疫苗研究存在如下不足之处:难以确定最佳刺激剂量，抗原成分复杂，可能诱发自身免疫性疾病，所用的抗原多肽不一定能诱导最佳的抗肿瘤免疫反应，刺激剂量难以确定等。关于目前的DC疫苗临床试验多集中于Ⅰ/Ⅱ期，距离临床应用仍有较远距离。对于晚期的肿瘤患者，DC疫苗几乎不能产生客观的免疫应答。人们也正在针对识别更有效的临床免疫治疗手段上作出更大的努力，比如，在提供一定的佐剂的情况下，早期接种肿瘤疫苗的效果要优于晚期肿瘤的免疫治疗。以DC为基础的肿瘤免疫疗法已经显现出临床应用前景，是未来抗肿瘤治疗的很有前景的手段之一。

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