电针对非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清及肝组织SOD和MDA的影响

程井军(湖北中医药大学针灸基础教研室，湖北 武汉430061）

李德顺(湖北中医药大学方剂学教研室，湖北 武汉430061）

马 骏，沈 峰(湖北中医药大学针灸学教研室，湖北 武汉430061）

齐凤军(湖北中医药大学推拿学教研室，湖北 武汉430061）

孙国杰(湖北中医药大学针灸学教研室，湖北 武汉430061）

非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH）与肥胖、高脂血症和糖尿病高度相关[1]，但其发病机制不明。我们应用电针刺激SD大鼠肝俞、足三里、丰隆、太冲，观察电针对高脂饮食所致的非酒精性脂肪性肝炎(NASH）大鼠血清及肝组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD）和丙二醛(malondialdehyde，MDA）的影响，为临床治疗非酒精性脂肪性肝炎提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料

SPF级雄性SD大鼠(南方医科大学动物实验中心，批号2004A068）40只，体质量(190±20）g；上海产G-6805针灸治疗仪；熊去氧胆酸片(UDCA，成都市湔江制药厂）；血清超氧化物歧化酶和丙二醛试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1．2 方法

1．2．1 动物分组与模型建立 选用SPF级雄性SD大鼠40只，采用清洁级架式分笼饲养。所有大鼠均正常喂养1周，再随机分为4组。正常对照组10只，普通饲料喂养；模型组10只，电针组10只，药物组10只，均采用高脂饲料喂养。实验依据范建高经典造模方法[2]，自由摄食和饮水，饲料和水每日更换1次。针刺组取穴参照全国协编 《动物实验针灸学》标准穴位图谱定肝俞、足三里、丰隆、太冲，电针治疗，选用0．5寸长毫针(1cm）电针穴位，上海产G-6805针灸治疗仪(疏密波8～80Hz，疏密波转换14次／min，电压1．5V，强度1mA）通电治疗20min，自第12周开始每天治疗1次，连续6d后休息1d，共治疗4周。药物组自第12周开始每天以西药UDCA 250mg／（kg·d）的水溶液为唯一饮料，继前高脂食物喂养共4周。正常组和模型对照组不进行电针和药物治疗，喂养共16周。各组在16周后隔夜空腹以2%戊巴比妥钠麻醉，经下腔静脉采血，并颈椎脱臼处死动物，摘取肝脏。

1．2．2 观察项目与测定方法

1）一般情况。观察动物体质量(分别于实验前至第16周末用电子秤称量各组大鼠的体质量）、食欲、行为、状态、毛发及死亡情况，计算肝指数(肝脏湿质量／体质量×100%）。

2）血清ALT、AST测定。检测血清ALT、AST采用Olympus Au560全自动生化分析仪测定。

3）血清SOD、MDA含量测定。分别采用邻苯三酚自氧化抑制法、硫代巴比妥荧光法测定血清SOD、MDA含量。

4）肝组织SOD、MDA含量测定。按试剂盒操作说明用生物化学法分别测定SOD、MDA含量。

5）肝组织病理变化观察。将肝组织用4℃生理盐水冲洗，在肝脏最大叶距边缘5mm处取小块肝组织，中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肝组织普通病理变化。

1．3 统计学分析

应用SPSS11．0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，两样本均数的比较采用t检验，等级资料采用秩和检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 各组大鼠一般情况变化

实验结束时模型组和西药组分别有2只和1只动物因相互撕咬而死亡，模型组大鼠体质量增长最迅速，食欲好，且动物性情较温顺，活动减少；第13～16周，电针组体质量增加明显减慢。体质量及肝指数模型组比正常组显著增高(P＜0．01）；模型组比电针组显著增高(P＜0．01）；西药组较之电针组增高(P＜0．05）。见表1。

表1 各组大鼠体质量、肝指数的变化

2．2 各组大鼠肝功能比较

模型组比正常组显著增高(P＜0．01）；模型组比电针组显著增高(P＜0．01）；电针组较之西药组有下降趋势，但两者比较无明显差异(P＞0．05）。见表2。

表2 各组大鼠肝功能比较

2．3 各组大鼠血清SOD活性、MDA含量的变化

模型组血清MDA显著高于正常组(P＜0．05），SOD活性显著低于正常组(P＜0．05）；电针组与模型组比较，MDA含量显著降低(P＜0．05），而SOD活性明显升高(P＜0．05）；电针组与药物组比较，MDA含量有下降趋势，有统计学差异(P＜0．05）；而SOD活性有下降趋势，但无统计学差异（P＞0．05）。见表3。

2．4 各组大鼠肝匀浆SOD活性、MDA含量的变化

模型组肝组织MDA显著高于正常组(P＜0．05），SOD活性显著低于正常组(P＜0．05）；电针组与模型组比较，MDA含量显著降低(P＜0．05），而SOD活性明显升高(P＜0．05）；电针组与药物组比较，MDA含量有下降趋势，有统计学差异(P＜0．05）；而SOD活性亦有下降趋势，但无统计学差异(P＞0．05）。见表4。

表3 各组大鼠16周时血清MDA含量、SOD活性比较

表4 各组大鼠16周时肝组织MDA含量、SOD活性比较

2．5 各组大鼠肝脏组织病理学检查

2．5．1 肝脏外观形态观察 正常组肝脏外观呈鲜红色，质地软而富有弹性；模型组肝脏体积呈均匀性增大，边缘锐利，表面光滑，质软。表面及切面呈黄红色，有油腻感。电针组及西药组肉眼观察差别不明显，色泽较暗，质地、弹性均介于模型组和正常组之间。

2．5．2 光镜下肝脏病理学改变 正常组大鼠肝细胞形态排列正常，肝小叶清晰规则，细胞质均匀，偶见小泡性脂肪滴空泡；模型组所有大鼠均出现程度不等的弥漫性肝细胞浊肿、脂肪变性，脂变肝细胞体积增大，细胞质内可见数量不等、大小不一的脂肪空泡，胞核被推向周边；肝组织均存在小叶内炎症，大部分组织可见汇管区炎症，且出现肝细胞点、片状坏死(见图1）。电针组肝组织脂肪变程度明显减轻，肝细胞形态趋于正常(见图2）。西药组病理学改变介于模型组和电针组之间。

图1 模型组大鼠肝细胞光镜下形态(HE，×400）

图2 电针组大鼠肝细胞光镜下形态(HE，×100）

3 讨 论

由单纯的脂肪肝发展至NASH，氧化应激或肝中氧化抗氧化平衡失调，可能是其重要机制。线粒体是氧化应激和活性氧簇(ROS）产生的最大来源[3-4]。肝内过多的FFA，特别是多不饱和脂肪酸，可损害细胞生物膜及线粒体呼吸链，使线粒体的改变和呼吸链功能不全，从而使脂肪酸β氧化及肝氧化增加，不平衡的氧化磷酸化导致自由基形成[5]；氧化应激还与FFA诱导CYPⅡE1和CYP4A表达增强相关。临床和实验表明，CYPⅡE1在脂肪性肝病中表达增强[6]。CYPⅡE1具有很强的氧化活性，是ROS的重要来源。高表达的CYPⅡE1在氧化基质的同时，释放大量的ROS和自由基。过多的ROS和自由基耗竭谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等抗氧化因子，使促氧化物与抗氧化物之间的动态平衡失调，即出现氧化应激状态。

氧化应激通过多种途径促成肝损害：进一步影响呼吸链[7-8]，直接或间接氧化损害线粒体基因组，导致更多的ROS产生，如此恶性循环；降低肝谷胱甘肽水平，增加解偶联蛋白-2（UCP-2）的表达，导致ATP耗竭，降低肝细胞的应激能力[9]；使脂质过氧化，产生大量具有反应活性和细胞毒性的中间产物，导致细胞死亡、坏死，并通过细胞损伤产生炎症反应或吸引炎症细胞浸润肝实质[10]。此外，脂质过氧化还释放MDA和4-羟基己酸，能刺激Ito细胞核合成胶原，导致纤维化。4-羟基己酸能趋化中性粒细胞，导致炎症细胞浸润，MDA能使包括细胞骨架蛋白在内的蛋白质发生交联，形成Mallory小体[11]；提高几种CKs（TNF-alpha，TGF-beta）的表达，在细胞死亡、炎症反应和纤维化中发挥关键作用[12-13]。

针灸对脂质过氧化有重要影响。伦新等[13]取足三里、关元穴，对老年人实行隔姜灸，结果体内血SOD活性明显升高。孔立红等[14]取单侧肺俞、脾俞、肾俞穴，对糖尿病大鼠进行针灸，结果能明显提高大鼠血清SOD的活性。赵立荣等[15]取内关、太冲，可提高小鼠脑组织CAT活性。另外，孙忠人等[16]研究发现，针刺足三里穴能显著降低老龄小鼠血清和肝组织中MDA水平。

本实验证实：模型组肝组织MDA显著高于正常组(P＜0．05），SOD活性显著低于正常组(P＜0．05）；电针组与模型组比较，MDA含量显著降低(P＜0．05），而SOD活性明显升高(P＜0．05）；电针组与药物组比较，MDA含量有下降趋势，有统计学差异(P＜0．05）；而SOD活性有下降趋势，但无统计学差异(P＞0．05）。结果提示，电针能够提高肝组织抗氧化能力，减轻脂质过氧化，可能是其防治NASH的主要机制之一。

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