银杏叶提取物总黄酮含量分析方法的研究

郑启波

(哈尔滨仁皇药业有限公司，黑龙江 哈尔滨 150030)

银杏叶为银杏科植物，味苦、甘涩、性平，活血养心、敛肺涩肠。主治胸痹心痛，喘咳痰嗽，泄泻痢疾。银杏叶提取物(EGB)具有广泛的药理作用，其提取物(extract of Ginkgo Biloba，EGB)中主要活性成分为黄酮类和萜类内酯。它们在改善心脑血管循环、老年性外周循环障碍及老年痴呆症方面具有很好的疗效，有抑制血小板凝聚酶、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗癌等作用［1］。

1 实验部分

1.1 仪器与试药:UV－4600型紫外可见分光光度计(瑞典Pharmacia公司)，高效液相色谱仪，配备有600E型泵系统，966型二极管阵列检测器，RCMC18(8.0 cm × 1.0 cm，粒度:5 μm);芦丁、槲皮素(中国药品生物制品检定所)、山柰酚、异鼠李素(Sigma公司)、盐酸、甲醇、乙醇、丙酮均为分析纯。

1.2 提取工艺:取200 g干银杏叶粉碎，浸泡在2000 mL 70%乙醇中，在水浴上热回流提取2次，每次各3 h，过滤，2次滤液合并，在水浴上减压蒸馏，除去溶剂，用石油醚脱脂2次水溶液浓缩至原体积的1/10，后用20%乙醇悬浮，过滤，滤液中加入少量的硼砂，在水浴上减压蒸馏，回收乙醇，水液在水浴上浓缩成浆液状，控制在60℃温度下真空干燥，得提取物 29.35 g［2－3］。

1.3 实验方法

1.3.1 分光光度法

1.3.1.1 标准液及标准曲线。①标准液的配制:精密称取芦丁对照品23 mg，置于100 mL容量瓶中，用30%乙醇溶解，定容，备用。②标准曲线的制作:分别精密吸取上述芦丁的标准液0.5、1、2、3、4 mL 各置于 10 mL 容量瓶中，加 30%乙醇5 mL、5%NaNO2溶液 0.3 mL，摇匀，放置 5 min 后加入10%AL(NO3)3溶液 0.3 mL，6 min 后再加入 1 mol/L NaOH溶液2 mL，混匀，用30%乙醇定容，10 min后于波长510 nm处进行测定。吸收度(A)与其浓度(C，mg/mL)用最小二乘法求得回归方程;A=0.9881C+0.01072，r=0.9998，线性范围11.5～92μg/mL。

1.3.1.2 样品的测定。精密称取银杏叶提取物约0.02 g 5份，各置10 mL量瓶中加30%乙醇溶液，按上述方法测定吸收度，用回归方程计算总黄酮的百分含量［4］，结果为32.70%、32.04%、32.17%、32.40%、31.98%。

1.3.2 高效液相色谱法

1.3.2.1 色谱条件。色谱柱:RCMC18(8.0 cm ×1.0 cm，粒度:5μm);流动相:甲醇 －0.4%磷酸溶液(55:45);流速:1.0 mL/min;进样量:10 μL;检测波长:360 nm;柱温:25 ℃。

1.3.2.2 溶液制备。对照品溶液的制备:精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品适量(15.6，17.0，10.0 mg)置 100 mL 量瓶中，加甲醇微热使溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

1.3.2.3 样品测定。标准曲线的制作:精密量取上述对照品溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置 10 mL 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，各进样20μL，按上述色谱条件测定，以对照品浓度C(μg·mL－1)为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，结果如下。

槲皮素:A=80 074C －52 255，r=0.999 4，线性范围为15.6 ～78.0 μg·mL－1

山柰素:A=63 168C+35 558，r=0.998 2，线性范围为17.0 ～85.0 μg·mL－1

异鼠李素:A=60 465C+20 840，r=0.999 6，线性范围为10.0 ～50.0 μg·mL－1

精密称取银杏叶提取物0.2 g 5份，按上述色谱条件测定，分别计算槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量［5－6］，按公式总黄酮醇含量=(槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量)× 2.51，结果为 30.96%、30.85%、31.02%、31.65%、31.82%。

回收率测定:精密称取银杏叶提取物0.1 g，共5份，分别精密加入槲皮素、山柰素、异鼠李素混合对照品溶液10 mL(浓度分别为 0.156，0.170，0.100 mg·mL－1)，按上述方法测回收率，得平均回收率为98.9%，RSD=1.12%(n=5)。

2 结果与讨论

实验中，采用紫外可见分光光度法和高效液相色谱法对银杏叶提取物总黄酮进行含量测定。结果显示，UV测得总黄酮平均含量33.87%;HPLC以槲皮素对照品法测得为31.26%。经比较认为，紫外可见分光光度法作为一种简便、准确的质量控制方法，可应用于工厂的实际生产工作中。

实验过程中发现银杏叶提取物(主要总黄酮)含量有多羟基易氧化成分，随着在提取过程中的温度升高和加热时间的延长，颜色明显加深，若在加热过程中加入少量的硼砂和亚硫酸氢钠，可能是对酚羟基的保护作用，则结果有明显的改善。

3 分析与应用

在开发银杏制剂的时候，为了保持活性成分的稳定，应该对提取物中氧化因素加以考虑，在工艺过程中采取必要的抗氧化措施。以芦丁为对照品，取银杏叶提取物约0.02 g置于10 mL量瓶中，同上操作，以试液作空白，分别加入NaNO2溶液(0.1 ～ 0.4 mL)，AL(NO3)3溶液(0.1 ～0.4 mL)和NaOH 溶液(0.5～4.0 mL)，测得的吸收度基本不变，说明黄酮类化合物与三价铝离子形成的络合物是稳定的。在系统中分别加入芦丁含量20倍的各种糖类如蔗糖、乳糖、葡萄糖，再测其吸光度，变化也很小，说明糖类不干扰总黄酮的测定。用试剂作空白消除了显色前黄酮颜色的干扰。测试温度均为25℃，以消除温度对络合物稳性的影响。

4 结论

本文通过紫外可见分光光度法和高效液相色谱法对提取物中的银杏叶总黄酮含量的测定，进行了相互的比较，从而确立了紫外可见分光光度法为银杏叶总黄酮含量测定常用方法中较为快速、简便、准确的方法。同时以高效液相色谱法作为测量手段，以总黄酮的回收率作为指标，对银杏叶的提取工艺进行探讨，确定了提取溶剂、时间及干燥温度等提取工艺参数，为工业化生产提供了重要参考依据。

［1］刘桂霞，孙玉玮，金兆祥.银杏叶的研究进展［J］.国外医药.植物药分册，1994，9(1):10.

［2］沙怀，陈桂先，马莉，等.银杏叶中总黄酮的提取与测定［J］.中国药房，1995，6(5):13 －14.

［3］庄向平，虞庆英，杨更生，等.银杏叶中总黄酮的测定和提取方法［J］.中草药，1992，23(3):122.

［4］李梅，杨正鸿，王坚毅.紫外分光光度法测定复方银杏叶胶囊中银杏叶总黄酮含量［J］.中国医院药学杂志，1998，18(2):85.

［5］国家药典委员会.中国药典:Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社，2005:597.

［6］陶巧风，黄宗玉，范秀林.高效液相色谱法测定银杏叶制剂中黄酮含量［J］.中成药，1993，15(12):14.