浅部真菌感染直接镜检有关问题探讨

蒙在杨

浅部真菌病是由寄生于皮肤角蛋白组织的致病真菌所引起的皮肤病，包括头癣、须癣、体股癣、叠瓦癣、手足癣、甲真菌病、花斑癣和马拉色菌毛囊炎等是皮肤科的常见病和多发病。直接镜检是实验室诊断皮肤真菌病常用的快速、可靠的方法[1]。通过将鳞屑溶解于氢氧化钾溶液后直接镜检证明损害部位刮取的鳞屑内有病原真菌存在。实际工作中，一些因素使直接镜检法检测结果受到影响，可能会出现假阳性或假阴性。现对操作中出现的一些问题进行探讨，旨在提高检测结果的准确性。

1 载液的选取

载液同标本反应的时间长短和使用不同的载液处理标本可影响皮屑直接镜检的阳性率，在临床上应根据皮损的角化程度选用不同的载液。

1.1 10% KOH溶液 10%KOH溶液滴加在玻片上，水份随镜检时间的延长而挥发，特别是室内温度高时，KOH相对浓度增加，对皮屑较少的标本有时会使真菌溶解,造成假阴性。无明显角化的皮屑镜检要及时完成，因为干涸形成结晶,不利于形态辨认，造成镜检困难。明显角化的皮屑可延长镜检时间，因为10%KOH溶液对角质溶解效果好。

1.2 10% KOH甘油溶液 10%KOH甘油溶液挥发缓慢，不易干涸而形成结晶，可延长涂片保存时间并利于检查，但对角质细胞溶解所需的时间较长。为了便于溶解，需要加热,如果温度掌握不当可致玻片破裂，甚至载液沸腾蒸发形成结晶或造成真菌特征性结构破坏,而增加镜检难度。当室温较低时玻片的余热与周围空气产生细微水雾而使显微镜镜头模糊。另外，10%KOH溶液有腐蚀性，溢出容易使显微镜载物台和聚焦镜损坏，不加盖玻片时当操作不当使显微镜物镜接触该溶液受到损伤。无明显角化的皮屑适合这种载液处理。

1.3 10% KOH二甲基亚砜溶液 在KOH溶液中加入40%二甲基亚砜，其特点可增加在KOH的通透性，加速角质细胞溶解，但放置时间过长可能破坏菌丝而出现假阴性。

2 标本的取材

取材要准确、足量包括被病原真菌感染的浅部组织如甲板、毛发和皮肤以及深部组织。尽量采取新被侵染的组织，如头癣的断发、癣病的边缘性损害、新鲜的水疱、甲真菌病的甲板深层、皮下真菌病的组织块和渗液、马拉色菌毛囊炎的毛囊内容物等。常用的取材方法有钝手术刀刮取法和胶带法等两种。

2.1 钝手术刀刮取法 在皮损处直接用钝手术刀将鳞屑刮在载玻片上，加入载液或染液后观察。本法多用于光滑无毛处皮损取材，是临床上最常用的方法，特别适用鳞屑多者。

2.2 胶带法 该法常用于花斑癣的取材。用透明两面胶带（文具店有售）取材。先将两面胶带的一面贴于待检皮肤，数分钟后取下，使非接触皮肤的胶带面贴于载玻片上，将与皮肤接触的那一面朝上并加入染液后观察。也可在载玻片上预先帖上两面胶带，再将此玻片胶带面压在皮损上，几分钟后将粘有标本的玻片胶带染色观察。如果是单面胶带，应该先滴加1滴染液于载玻片，再将贴于皮肤的粘面取下直接盖在载玻片镜检。本法对皮肤无损伤，无畏惧感，可多处反复取材，适用于鳞屑少或不宜刮取鳞屑者，利于儿童及不合作者的取材。

使用不同的取材方法影响皮屑直接镜检的阳性率，透明胶布粘贴法适用于无明显角化的皮损取材，尤其是有明显皮屑但无明显角化的皮损。锉刀刮取法适用于有明显角化的皮损取材。

3 标本的适当处理

对富含角质蛋白的皮屑、毛发、甲屑等用含10%KOH溶解角质蛋白，对菌量少不易确定的标本可滴加复方派克墨水染液进行染色以增加辨认度。

4 调整显微镜

首先降低聚光器，调暗视野，利于突出真菌成分的折光度，其次在低倍镜下多视野仔细寻找目标，然后转高倍镜辨认形态。

5 镜检

真菌菌丝和孢子具有折光性，标本经10%KOH溶解后，镜下呈暗绿色荧光。真菌菌丝和孢子在镜下特点：圆筒形细胞沿长轴方向连接，前端边分枝边形成丝状结构，这就是菌丝；菌丝在一定的间距形成横隔,叫隔膜，它把菌丝分成一连串的细胞,有横隔的菌丝叫有隔菌丝,无横隔的菌丝叫无隔菌丝；菌丝的发育点在其前端，边分枝边生长,形成网状、树枝状及束状的集合体，这就是菌丝体。孢子常呈圆形、卵圆形或筒形。标本经10%KOH溶解后，在被溶解上皮细胞的轮廓中还可看到一些带折光性的颗粒，这些颗粒是一些细胞器，大小与真菌的孢子相当，容易被误判成孢子。角质形成细胞的边缘不易被溶解，也常被误看成是菌丝，检测者应该微调显微镜光线的强弱，如果出现上皮细胞的轮廓，则可以排除是真菌。此外，背景中的气泡、纤维丝、脂肪滴等杂质也具有一定的折光性，容易被当成菌丝或孢子，应滴加派克墨水染液进行染色，经染色后的标本镜下菌丝和孢子被染成蓝色，而背景中的细胞器、角质细胞、脂滴、气泡、纤维丝等均不着色，对比鲜明，便于确认。

[1] Difonzo EM, Faggi E. Skin diseases associated with Malassezia species in humans. Clinical features and diagnostic criteria[J]. Parassitologia,2008, 50(1-2): 69-71.