人骨髓间充质干细胞与脐静脉内皮细胞体外共培养的研究

刘春晓 吴欢欢 马慧雨 康宁 曹谊林 肖苒 尹宁北

·论著·

人骨髓间充质干细胞与脐静脉内皮细胞体外共培养的研究

刘春晓 吴欢欢 马慧雨 康宁 曹谊林 肖苒 尹宁北

目的观察人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stromal cells，hBMSCs）与脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，hUVECs）体外共培养对hBMSCs成骨作用及hUVECs成血管功能的影响。方法分离鉴定hBMSCs和hUVECs，将hBMSCs及hUVECs按1∶1比例直接共培养，倒置相差显微镜观察细胞的生长特性和细胞相容性，Matrigel实验观察共培养对hUVECs体外血管形成能力的影响。将hBMSCs成骨诱导7 d后，茜素红染色观察共培养对其成骨分化能力的影响。结果hBMSCs与hUVECs体外共培养细胞相容性良好，Matrigel实验显示共培养组形成的毛细血管状结构较单一细胞组多。成骨诱导的hBMSCs中，共培养组茜素红染色阳性，单一细胞组茜素红染色阴性。结论hBMSCs与hUVECs具有良好的细胞相容性，在共培养体系中，未诱导的hBMSCs能促进形成毛细血管状结构，已成骨诱导的hBMSCs成骨矿化能力增强。

组织工程骨髓间充质干细胞脐静脉内皮细胞共培养

组织工程骨的预制技术为骨缺损的修复提供了新的方法。但是体外构建的单纯组织工程骨，移植入体内后依靠组织液渗透仅能营养100 μm以内的细胞[1]，中央的细胞供血和供氧受到限制，出现成骨不良及成骨质量不佳等问题，使得组织工程骨无法有效修复体积较大的骨缺损。因此，血管化是解决组织工程骨临床应用问题的关键。

研究发现，在骨缺损修复的过程中，成骨细胞与血管内皮细胞之间存在着密切的联系[2]。本实验将成骨诱导后的人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stromal cells，hBMSCs）和脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，hUVECs）直接共培养，观察两种细胞的生物相容性，探讨hUVECs对hBMSCs成骨作用及hBMSCs对hUVECs成血管能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

Ficoll淋巴细胞分离液（G&E公司，瑞典）；胎牛血清、胰蛋白酶、青链霉素、DMEM培养基（HyClone公司，美国）；肝素、地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、茜素红、PBS缓冲液（Sigma公司，美国），EGM-2（Lonza公司，瑞士）；鼠抗人OPN（Abcam公司，英国）；流式抗体CD31-FITC、CD34-PE、FITC和PE同型对照（BD公司，美国）；Accuri C6流式细胞仪（Accuri公司，美国）；倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）；骨髓血与脐带来源于无全身性疾病的临床志愿者。

1.2 hBMSCs的分离培养和鉴定

1.2.1 hBMSCs的分离纯化和扩增

采用密度梯度离心法分离hBMSCs，将经过抗凝处理的骨髓血缓慢加入含有等体积Ficoll分离液的离心管中，2 000 r/min离心20 min，吸取中间乳白色云雾状单个核细胞层，PBS冲洗2遍，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入基础培养基（DMEM-LG培养基，10%胎牛血清，1%青、链霉素），反复吹打成单细胞悬液，接种于25 cm2培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，隔天换液。7～10 d后待细胞生长至80%～90%时，0.25%胰酶消化传代，按1×104cells/cm2密度接种于新的培养瓶中。本实验使用第3～5代的hBMSCs。

1.2.2 HBMSCs的多向诱导分化

1.2.2.1 成骨诱导

取第3代hBMSCs，以1×104cells/cm2密度接种于6孔培养板中，每孔内预置3枚1 cm×1 cm盖玻片，加入2 mL成骨诱导培养基（DMEM-HG培养基，10%胎牛血清，10-8mmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，50 mg/L抗坏血酸，1%青、链霉素），置于37℃、5%CO2培养箱内培养，隔天换液。倒置显微镜观察细胞形态。诱导7 d后，4%多聚甲醛固定15 min，0.1 mol/L的PBS轻轻冲洗3遍，取出盖玻片，进行骨桥蛋白（Osteopetin，OPN）免疫细胞化学检测。取第3代未成骨诱导的hBMSCs爬片作为阴性对照。

1.2.2.2 成脂肪诱导

取第3代hBMSCs，以1×104cells/cm2密度接种于6孔培养板中，每孔内加入2 mL成脂肪诱导培养基（DMEM-HG培养基，10%胎牛血清，0.5 μM氢化可的松，0.5 μM IBMX，60 μM消炎痛，10 μg/mL胰岛素，1%青、链霉素），置于37℃、5%CO2培养箱内培养，隔天换液。倒置显微镜观察细胞形态。诱导10 d后，钙-福尔马林固定10 min，0.1 mol/L的PBS轻轻冲洗3次，60%异丙醇处理2 min，加入油红O染液，置于脱色摇床震荡30 min后，镜下观察。

1.3 hUVECs的原代培养和鉴定

1.3.1 hUVECs的原代分离和扩增

无菌条件下取新生儿脐带（长约20 cm），找出脐静脉，注入0.1%胶原酶Ⅱ，置于预热PBS烧杯中，37℃孵育5 min，收集消化液，注入EGM-2培养基，再次冲洗静脉管腔，将消化液与冲洗液一并收集于离心管，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入EGM-2培养基，轻轻吹打均匀，接种于75 cm2培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，24 h后更换培养液，去除未贴壁的细胞，隔天换液，细胞生长融合至80%～90%时，按上述方法传代。本实验使用第2～3代的hUVECs。

1.3.2 hUVECs的表面标志物检测

取第2代hUVECs，PBS冲洗3遍，用0.25%胰酶消化成单细胞悬液，计数，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬，样品管和对照管各加入100 μL细胞悬液，含1×106个细胞。样品管加鼠抗人荧光标记单克隆抗体CD31-FITC、CD34-PE各10 μL，对照管加入10 μL FITC或PE标记的鼠IgG1同型对照抗体作为阴性对照，4℃避光孵育30 min。PBS重悬，2 000 r/min离心3 min，重复洗涤3遍。1%多聚甲醛固定，定容至200 μL，4℃避光保存，次日流式细胞仪检测细胞表面标志物。

1.4 hBMSCs和hUVECs的直接共培养

1.4.1 Matrigel测定共培养体系中内皮细胞血管形成能力

将Matrigel置于4℃过夜融解，取30 μL加入96孔板，37℃孵育1 h，使Matrigel聚合成胶。取未诱导的hBMSCs与hUVECs，分别消化，调整细胞密度为1×106cells/mL，设立1个实验组及2个对照组，每组复设5孔，实验组于96孔板每孔内各加入100 μL hBMSCs与hUVECs细胞悬液，使hBMSCs与hUVECs比例为1∶1，对照组仅加入100 μL hBMSCs或100 μL hUVECs，用培养基补至200 μL。实验过程保持冰上操作。每2 h在倒置显微镜下观察细胞形态，检测hBMSCs对hUVECs成血管能力的影响。

1.4.2 茜素红染色检测共培养对成骨诱导的hBMSCs功能的影响

取成骨诱导7 d的hBMSCs与hUVECs，分别消化，调整细胞密度为1×105cells/mL，于6孔板每孔内各加入1 mL hBMSCs与hUVECs细胞悬液，使hBMSCs与hUVECs比例为1∶1，以单纯hBMSCs为对照组。置于37℃、5%CO2培养箱内培养，细胞贴壁后更换为不含成骨诱导成分的培养基，隔天换液。倒置显微镜观察共培养的细胞形态和生长情况。7 d后，4%多聚甲醛固定15 min，0.1 mol/L的PBS轻轻冲洗3次，每孔加入1 mL 1%茜素红-Tris-HCL（pH 4.7），37℃孵育30 min，用PBS冲洗数次，镜下观察。

2 结果

2.1 hBMSCs形态学观察及鉴定

2.1.1 hBMSCs原代及传代培养

原代细胞接种48 h后，可见hBMSCs在培养瓶底散在分布，伸展成梭形，与周围圆盘状血细胞相互混杂。4 d后，可见细胞呈成纤维细胞样集落生长。5～10 d，细胞生长迅速，形成大集落，呈漩涡状排列。各个集落之间逐渐融合，不发生接触抑制，集落生成细胞生长速度显著快于散在的细胞。传代后，细胞进入快速增殖期，形态更加单一，体积增大呈纺锤型，细胞排列有规则的方向性（图1）。

图1 原代hBMSCs体外培养第14天（倒置相差显微镜，40×）Fig.1Primary cultured hBMSCs 14 days after culture (Inverted phase contrast microscope,40×)

2.1.2 OPN染色鉴定hBMSCs成骨分化能力

hBMSCs在体外成骨诱导7 d，细胞体积变大，形态变为多边形，核大，核仁清晰，细胞内颗粒增多，细胞外基质（Extra Cellular Matrixc，ECM）分泌旺盛，局部细胞相互连接成膜状。OPN免疫细胞化学染色可见胞浆中有棕色颗粒，为阳性，未成骨诱导的hBMSCs未见有阳性表达（图2）。

图2 体外成骨诱导7 d（OPN染色，倒置相差显微镜，100×）Fig.2Seven days after induced osteogenesis (OPN STAINING,Inverted phase contrast microscope,100×)

2.1.3 油红O染色鉴定hBMSCs成脂肪分化能力

hBMSCs加入成脂肪诱导培养基后，细胞形态发生明显变化，细胞体积变大，逐渐由长梭形变为多边形，椭圆形等脂肪细胞样形态，胞浆内可见明显脂肪滴，且细胞增殖明显减慢。油红O染色可见胞浆内呈红色，为阳性，说明细胞内出现脂肪滴，对照组未见阳性表达（图3）。

2.2 hUVECs的形态观察及表面标志物鉴定

图3 体外成脂肪诱导10 d（倒置相差显微镜，100×）Fig.3hBMSCs 10 days after being induced towards lipoblasts (Inverted phase contrast microscope,100×)

hUVECs为单层贴壁生长，大部分在原代分离24 h后完全贴壁，相差显微镜下见细胞成团或散在贴附在培养瓶上，呈梭形或多角形，胞核椭圆居中，互不重叠。3～5 d后融合，低倍镜下呈典型的铺路石样外观（图4）。流式细胞仪检测CD31阳性率为92.6%，CD34阳性率为28.6%，提示为成熟内皮细胞（图5）。

图4 原代hUVECs体外培养4 d（倒置相差显微镜，40×）Fig.4Primary culture hUVECs 4 days after culture (Inverted phase contrast microscope,40×)

图5 流式细胞仪检测hUVECs表面标志Fig.5Flow cytometry analysis of endothelial phenotype of hUVECs

2.3 hBMSCs与hUVECs共培养

2.3.1 共培养大体形态观察

倒置显微镜下观察可见在直接接触培养条件下，两种细胞均贴壁生长并维持各自细胞形态，hBMSCs呈长梭形，有粗大的角状突起，体积较大; hUVECs呈卵圆形，类似鹅卵石状，体积较小。随着时间延长，相邻细胞彼此贴靠融合，相互交织生长，未发生接触抑制，无排斥、吞噬等现象（图6）。

图6 hBMSCs与hUVECs以1∶1共培养2 d（倒置相差显微镜，40×）Fig.6hBMSCs 2 days after directly co-cultur with hUVECs in a ratio of 1∶1 (Inverted phase contrast microscope,40×)

2.3.2 Matrigel血管形成能力检测

接种即刻可见细胞呈圆形分散在Matrigel内，2～3 h后可见细胞伸出伪足向周围扩散，4 h后可见细胞间相互衔接形成闭合环状结构，即管腔样毛细血管网状结构，提示Matrigel实验阳性，说明hUVECs保持成血管能力。共培养组形成了广泛的管腔样毛细血管网状结构（图7），比单纯hUVECs组（图8）形成的毛细血管网状结构致密粗厚，单纯hBMSCs组仅有少量不连续的管腔样结构（图9），提示共培养的hUVECs血管形成能力优于单一细胞培养。

图7 hBMSCs与hUVECs以1∶1接种于Matrigel后4 h（倒置相差显微镜，40×）Fig.7hBMACs and hUVECs 4 hours after seeding onto Matrigel coated wells (Inverted phase contrast microscope,40×)

图8 hUVECs单独接种于Matrigel后4 h（倒置相差显微镜，40×）Fig.8hUVECs seeded onto Matrigel coated wells alone 4 hours after seeding(Inverted phase contrast microscope,40×)

图9 hBMSCs单独接种于Matrigel后4 h（倒置相差显微镜，40×）Fig.9hUVECs seeded onto Matrigel coated wells alone 4 hours after seeding(Inverted phase contrast microscope,40×)

2.3.3 hBMSCs茜素红染色

成骨诱导的hBMSCs与hUVECs共培养7 d后可见实验组于皿底有白色矿化结节形成，结节中心细胞重叠，呈放射状排列，周边细胞稀疏，茜素红染色为深红色，提示ECM中出现大量钙盐沉积，包裹细胞形成钙结节。单纯hBMSCs对照组未出现钙结节，茜素红染色阴性（图10）。

图10 成骨诱导7 d的hBMSCs与hUVECs共培养7 d后（倒置相差显微镜，40×）Fig.10hBMSCs 7 days with hUVECs co-culture after being induced towards lipoblasts (Inverted phase contrast microscope,40×)

3 讨论

组织工程骨为临床骨缺损的治疗提供了新的思路。骨组织工程技术应用自体种子细胞与可降解支架材料结合，可构建与人体骨组织结构相同的活性骨组织，修复机体骨缺损，同时避免了临床上现行的自体骨移植技术“以创伤修复创伤”的弊端，以及异体骨移植的感染、免疫排斥等副作用[3]。BMSCs因其多向分化能力以及成骨分化潜能成为骨组织工程重要的种子细胞[4-5]。目前，体外构建的单纯组织工程骨是种子细胞和生物材料的复合体，本身没有营养来源，宿主血管长入的速度不能满足种子细胞的营养和供氧需求，因此，形成的新生骨的数量和质量均不能满足临床修复大范围骨缺损的需要。

血管化在骨损伤修复和再生过程中是极为重要的，新生血管不仅是运送氧气、营养物质及运走代谢废物的途径，它还是参与骨修复调控的信号分子、生长因子和细胞运输通过的重要通道。研究发现，组织工程骨的血管化程度与新骨形成的数量呈正相关，同时血管能运走生物材料代谢物，使成骨速率与材料降解率达到同步[6]。因此，组织工程骨的有效血管化成为骨组织工程迈向临床应用的关键环节。目前，组织工程骨血管化方法通常包括：将血管内皮细胞与成骨及其前体细胞联合培养[7]，添加促血管生成的生长因子[8]，将血管束植入组织工程骨[9]，动静脉吻合环绕组织工程骨[10]等。研究表明，上述方法能提高组织工程骨构建的效率和骨缺损的修复效果。

本实验以hUVECs与未诱导和成骨诱导的hBMSCs共培养，有效地模拟了体内微环境。研究结果显示，hBMSCs与hUVECs具有良好的细胞相容性，未诱导的hBMSCs能协助并促进hUVECs形成毛细血管状结构；已成骨诱导的hBMSCs在使用成骨诱导因子的情况下加入hUVECs，可以维持成骨表型，成骨活性和矿化形成能力增强。其机制可能是：①hBMSCs可表达血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），VEGF在血管发生和形成过程中有重要的作用[11]，可促进内皮细胞的增殖和血管形成能力[12]；②未诱导的hBMSCs在与内皮细胞共培养时，有部分向血管肌层细胞分化，协助内皮细胞形成血管管腔[13]，有助于新生血管的稳定，增强其长期存活率[14]；③hBMSCs促内皮细胞分泌骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP-2）[15]，促进已成骨诱导的hBMSCs进一步向成骨细胞分化[16-17]。但是，两种细胞在直接接触培养时通过什么途径形成功能相互促进，以及各诱导因子发挥作用的机制，目前仍未阐明，还有待进一步探讨和研究。

本实验证实，直接共培养可分别提高血管内皮细胞的成血管功能和成骨诱导的BMSCs的成骨矿化能力。BMSCs-支架复合物体外联合血管内皮细胞共培养使组织工程骨预血管化，可以为种子细胞提供正常的营养和生长调控，是骨组织工程血管化的理想方法。

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Experimental Study on the Co-Culture of Human Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells and Human Umbilical Vein Endothelial Cells in Vitro

LIU Chunxiao1,WU Huanhuan1,MA Huiyu2,KANG Ning1,CAO Yilin1,XIAO Ran1,YIN Ningbei1.1 Plastic Surgery Hospital（Institute）,CAMS,PUMC,Beijing 100041,China;2 Dental Hospital,Jiamusi University,Heilongjiang 154007,China.Corresponding author:YIN Ningbei(E-mail:yin_nb@126.com).

ObjectiveTo observe the effects of co-culture of human bone marrow mesenchymal stromal cells(hBMSCs) and human umbilical vein endothelial cells(hUVECs)in vitro on the osteogenesis and angiogenesis respectively.Methods Isolated and identified hBMSCs and hUVECs were directly co-cultured by a ratio of 1∶1.Growth and compatibility of the cells were observed with inverted phase contrast microscope.Matrigel experiment was used to test the ability of hUVECs to form networks of capillary-like structures under co-culture.After 7 days of osteogenic induction,the effect of co-culture on the osteogenesis of hBMSCs was assessed by Alizarin-Red staining.ResultsThe compatibility of hBMSCs and hUVECs was good.hUVECs co-cultured with hBMSCs exhibited denser microcapillary-like networks in Matrigel experiment than hUVECS.Osteogenic-induced hBMSCs co-cultured with hUVECs showed positive by Alizarin-Red staining,while it was negative in osteogenic-induced hBMSCs.ConclusionThe compatibility of hBMSCs and hUVECs was good.In the coculture system,the ability of hUVECs to form microcapillary-like networks can be enhanced,so as the calcification activity of osteogenic-induced hBMSCs.

Tissue engineering;Bone marrow mesenchymal stromal cells;Umbilical vein endothelial cells;Co-culture

Q813.1+1

A

1673－0364（2011）02－0065－06

2011年2月1日；

2011年3月7日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.02.002

北京市科技计划项目（D09080703660901）。

100041北京市中国医学科学院整形外科医院（刘春晓，吴欢欢，曹谊林，肖苒，尹宁北）；154007黑龙江省佳木斯市佳木斯大学附属口腔医院（马慧雨）。

尹宁北（E-mail:yin_nb@126.com）。