帕米磷酸钠对成骨不全成骨细胞和成纤维细胞增殖分化的研究

李公超 任秀智 王延宙 鲁艳芹 徐 超 韩金祥

1.山东省医学科学院山东省医药生物技术研究中心，山东省现代医用药物与技术重点实验室,山东 济南 250062；2。天津医院，天津 300211；3 山东省省立医院,山东 济南 250033

双磷酸盐是抑制破骨细胞活性的强有力的骨吸收抑制剂，在临床上被广泛应用于骨质疏松，骨肉瘤等病理性骨量丢失疾病。最近几年双磷酸盐类药物开始应用于成骨不全的临床治疗中。成骨不全（Osteogenesis Imperfecta）是一种由于间充质组织发育不全，胶原形成障碍而造成的先天性遗传性疾病，其发病率大约是1/ 10000[1]。其主要临床表现是青少年骨质疏松，骨脆性增加，易于骨折。目前针对成骨不全症手术治疗后的药物辅助治疗主要是采用双磷酸盐类药物。目前对双磷酸盐类药物作用机理的研究大多针对正常的成骨细胞或者成骨细胞系，本实验采用体外原代培养的成骨不全患者成骨细胞和成纤维细胞，取髋关节脱位患者原代培养成骨细胞和成纤维细胞为对照，研究第二代双磷酸盐帕米磷酸钠对成骨不全患者成骨细胞和成纤维细胞增殖分化功能的影响，探讨其在成骨不全症治疗中与临床治疗骨质疏松及骨肉瘤等疾病的异同性，为进一步探讨帕米磷酸钠在成骨不全症的药物治疗中的作用机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 帕米磷酸钠标准品；胶原酶I（sigma）；青链霉素、胰蛋白酶、培养液DMEM（Gibco公司）；胎牛血清；地塞米松；Trizol（invitrogen）碱性磷酸酶染色试剂盒（碧云天）；ALP活性检测ELISA试剂盒；MTT（QIAGEN公司）；倒置显微镜；酶免疫检测仪；CO2培养箱；

1.2 实验方法 1.2.1 细胞分离与培养 经山东省医学科学院伦理委员会批准以及受试者知情同意，术中取成骨不全患者和髋关节脱位患者股骨松质骨和大腿皮肤组织，分别至于含20ml无血清DMEM培养液（含10%青链霉素）。无菌条件下，取组织置于直径6cm一次性培养皿中，PBS清洗两遍除净血液，清除骨膜、血管及骨缝等结缔组织，剪碎骨组织至1mm×1mm大小, PBS液充分冲洗。胶原酶I 37℃消化5h， 离心去上清, 沉淀的细胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培养液, 吹打成细胞悬液，置于25cm2 培养瓶中在5%CO2、37℃饱和湿度条件下培养箱中培养。采用第三代成骨细胞和成纤维细胞。

1.2.2 成骨细胞鉴定 取原代培养的第三代成骨不全患者和髋关节患者成骨细胞，细胞长满约85%时倾去培养液，PBS清洗两遍，95%乙醇固定10min，碱性磷酸酶染色试剂盒染色液37℃避光孵育15min，倾去染色液PBS清洗两遍，倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.3 药物配制及分组 帕米磷酸钠粉末用PBS溶解，0.1N NaOH调整PH值至7.4，过滤除菌，储备液浓度为10-2M。取储备液逐级稀释至实验所需药物浓度10-3M-10-10M。设地塞米松浓度为10-9M为阳性对照。

取三例原代培养的成骨不全患者成骨细胞和成纤维细胞为实验组，以三例原代培养的髋关节脱位患者成骨细胞和成纤维细胞为正常对照组。

1.2.4 细胞增殖测定(MTT法) 取传代至3代得实验组和正常对照组成骨细胞和成纤维细胞以2x103/孔的密度铺板于96孔板中。每孔加含10%胎牛血清的DMEM培养液200ul，细胞过夜贴壁后更换含药培养基，阳性对照组换地塞米松培养基，对照组换普通培养基，每个浓度4个复孔，于加药后48h和72h进行MTT检测，每孔加入20μ lMTT(5mg/ml)，37℃孵育15min和30min后在酶免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值)，波长490nm，取其均值，计算细胞增殖率。以药物浓度为横轴，细胞增殖率为纵坐标绘制折线图。

1.2.5 碱性磷酸酶活性测定 实验组和正常对照组成骨细胞和成纤维细胞以1x104/孔的密度铺板于24孔板中，每组每例样本两种细胞各铺一板。细胞过夜贴壁后更换相应药物培养基，每个浓度2个复孔，加药后72h收集细胞培养上清液冻存与-20℃，贴壁细胞用PBS清洗2遍，加80ul Trizol充分裂解细胞收集裂解液。实验组和正常对照组成骨细胞和成纤维细胞每个复孔各取20ul细胞裂解液用于ELISA检测，酶免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值)，波长450nm，取其均值，通过标准曲线计算ALP活性值，以药物浓度为横坐标轴，ALP活性值为纵坐标绘制ALP活性变化折线图。

1.2.6 统计学分析 各组数据应用SPSS12.0软件处理,应用方差分析以及Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞形态及鉴定 成纤维细胞刚贴壁时呈长梭形或多边形（图1），细胞贴壁后7-10天长满（图2），10-14天细胞成簇状集落生长（图3）。成骨细胞贴壁后呈短梭形、三角形或多边形。碱性磷酸酶染色后大部分细胞被染成暗红色（图4），成纤维细胞碱性磷酸酶染色后，只有很少量细胞被染成淡红色（图5）。

2.2 细胞增殖检测 药物作用48h后，细胞增殖差异多数不显著（P>0.05）,72h时各浓度间差异显著（表1），显著性P<0.01。

当药物浓度为10-3M，10-4M时，均抑制实验组和对照组两种细胞的增殖。成骨不全成纤维细胞最佳增殖浓度为10-6M，成骨细胞最佳增殖浓度为10-8M。对照组成纤维和成骨细胞最佳增殖浓度分别为10-5M和10-7M。72h时各细胞增殖率对应药物浓度变化曲线见表2，表3。

表1 不同浓度药物处理对细胞增殖率的影响（±s，n=3）

表1 不同浓度药物处理对细胞增殖率的影响（±s，n=3）

浓度 10-3M 10-4M 10-5M 10-6M 10-7M 10-8M 10-9M 10-10M 地塞米松实验组FB (-14.4±1.3)% (-9.7±1.2)% (25.7±0.4)% (37.7±1.2)% (18.9±1.9)% (16.0±0.9)% (10.8±1.5)% (0.2±0.03)% (11.4±0.9)%实验组OB (-20.4±0.4)% (-12.1±1.4)% (12.9±0.9)% (20.8±0.3)% (34.5±0.7)% (42.8±0.4)% (14.6±0.6)% (13.9±0.5)% (13.8±0.3)%对照组FB (-11.5±0.2)% (-8.4±0.6)% (27.1±0.7)% (18.2±0.7)% (13.8±0.5)% (7.7±0.4)% (4.3±0.1)% (0.17±0.01)% (5.6±0.3)%对照组OB (-13.1±0.4)% (-4.7±0.4)% (13.7±0.7)% (22.5±0.4)% (36.7±0.4)% (32.4±0.5)% (16.4±0.3)% (15.7±0.7)% (11.8±0.5)%

表2 药物作用72h实验组与对照组成纤维细胞不同浓度下增殖率比较

表3 药物作用72h实验组与对照组成骨细胞不同浓度下增殖率比较

表4 不同浓度药物处理72h对细胞ALP活性的影响（ALP浓度U/L ±s，n=3）

表4 不同浓度药物处理72h对细胞ALP活性的影响（ALP浓度U/L ±s，n=3）

浓度 10-3M 10-4M 10-5M 10-6M 10-7M 10-8M 10-9M 10-10M 地塞米松 对照实验组FB 9.2±0.1 12.8±0.2 26.0±0.1 35.6±0.2 24.9±0.4 23.9±0.2 20.3±0.2 18.2±0.2 31.1±0.4 17.4±0.3实验组OB 24.2±0.4 30.2±0.6 65.3±0.8 72.4±0.5 95.0±0.8 101.9±0.6 66.8±0.9 60.7±0.5 84.6±0.3 38.6±0.4对照组FB 11.9±0.2 15.6±0.3 34.6±0.3 28.8±0.6 25.1±0.7 22.9±0.2 18.8±0.2 16.1±0.2 31.3±0.1 17.8±0.2对照组OB 31.4±0.4 39.9±0.3 56.9±0.7 60.5±0.5 100.5±0.7 88.6±0.5 58.3±0.2 56.8±0.3 77.6±0.7 50.1±0.1

表5 药物作用72h实验组与对照组成纤维细胞不同浓度下ALP活性比较

表6 药物作用72h实验组与对照组成骨细胞不同浓度下ALP活性比较

2.3 细胞ALP活性检测 两组样本两种细胞经药物处理后，在一定浓度范围内细胞ALP活性均增强（表4）。

其中实验组成骨细胞、成纤维细胞ALP活性最高值对应药物浓度分别为10-8M和10-6M，而对照组两种细胞ALP活性最高值对应药物浓度分别为10-7M和10-5M。以上两组样本两种细胞ALP活性变化趋势与细胞增殖趋势相对应，且各浓度间在药物作用72h时差异显著,显著性P<0.01。各组细胞ALP活性比较见表5、表6。

3 讨 论

双磷酸盐类药物可降低骨转换，抑制骨吸收，临床上常被用于治疗一些骨吸收亢进疾病，如绝经后骨质疏松症、Puget’s病等。以往对双磷酸盐的研究主要对破骨细胞的影响其对破骨细胞的影响机制主要是通过抑制破骨细胞内甲羟戊酸通路的关键酶使胞内的小G蛋白无法异戊二烯化，从而影响破骨细胞的生长和分化，促其凋亡[2]。近几年的研究发现双磷酸盐可通过成骨细胞间接抑制破骨细胞[3,4]。Igarashi[5]等发现3种不同的二磷酸盐在成骨样细胞株MC3T3-E1中抑制内生性前列腺素E2的产生,增强ALP的表达和矿化作用。Giuliani等[6]发现在鼠和人骨髓体外培养中, 二磷酸盐刺激成骨细胞前体细胞和矿化小瘤的形成。目前，针对双磷酸盐对成纤维细胞的作用机制探讨主要集中对双磷酸盐引起的颌骨坏死疾病（BRONJ）的探讨中，研究者发现采用不同剂量的唑来膦酸处理成纤维细胞，其中高于10 μM浓度的唑来磷酸盐即可引起成纤维细胞的程序性死亡，这种死亡机制部分是由胞内的甲羟戊酸途径介导的，而较低剂量的唑来磷酸盐则促进细胞增殖及IL-6，IL-8等细胞因子的表达[7]。Giuliani等[8]等发现双磷酸盐类药物促进集落生长的间充质干细胞表达成纤维细胞生长因子。同时有研究发现，采用三种含氮的双磷酸盐（伊班磷酸盐、帕米磷酸盐、唑来磷酸盐）处理人成骨细胞、成纤维细胞和脐静脉内皮细胞，低剂量的药物可促进细胞活力和迁移能力[9]。成骨不全症是由胶原合成相关基因突变导致的骨脆性增加，骨量丢失的遗传性疾病，病人临床体征呈现骨质疏松、肌无力、皮肤松弛等相关症状。从临床对成骨不全术后应用双磷酸盐药物治疗x光片显示，患者干骺端骨骨密度增高，说明该药物有利于患者骨质增强，同时，由于患者胶原蛋白的缺失引起的皮肤松弛，疤痕体质明显等症状在适当计量的双磷酸盐作用下也会有一定改善。

目前 ,对于双磷酸盐在体内的浓度变化很难做到有效的动态监测。有报道患者静注帕米磷酸钠后血液中的浓度可一过性达到10-5M[10],而在局部的骨吸收区域浓度更可高达10-3M[11]。本实验选用不同浓度梯度（10-3M～10-10M）的帕米磷酸钠作用于成骨不全症患者原代培养的成骨细胞和成纤维细胞，并以髋关节脱位患者成骨细胞和成纤维细胞为对照，研究结果显示，帕米磷酸钠对细胞的毒性作用在浓度≥10-4M时出现，实验组两种细胞最佳增殖浓度均比对照组两种细胞低十倍，而且实验组两种细胞增殖率均大于对照组，即实验组明显的表现出对药物剂量的敏感性高于对照组细胞。

ALP是骨形成所必需的酶,是识别和评价成骨细胞分化程度的早期指标,其活性反映成骨细胞的活性。ALP可催化分解有机磷酸释放无机磷，增加局部无机磷酸的浓度是启动矿化的必备条件。本实验发现在促进细胞增殖的药物浓度范围内，细胞ALP活性也有相应的提高，且ALP活性最高值也对应出现在细胞最佳增殖浓度。这说明一定剂量的帕米磷酸钠可以促进患者细胞碱性磷酸酶的表达，有利于患者成骨细胞和成纤维细胞的分化。

综上所述，一定剂量浓度的帕米磷酸钠可以促进患者成骨细胞和成纤维细胞的增殖并增强细胞ALP活性。但是，双磷酸盐类药物针对成骨细胞的活性调节机制尚不明确，而且体外细胞试验结果只能给临床该药物的给药剂量及给药途径提供一定的理论支持。真正意义上的两者结合还需要进一步的动物实验来解决。

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