细菌通过聚酮合成酶途径合成多不饱和脂肪酸的研究进展

万霞，江木兰*

(1.中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉430062;2.农业部油料作物生物学重点开放实验室，湖北武汉430062)

细菌通过聚酮合成酶途径合成多不饱和脂肪酸的研究进展

万霞1，2，江木兰1，2*

(1.中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉430062;2.农业部油料作物生物学重点开放实验室，湖北武汉430062)

细菌利用聚酮合成酶途径合成多不饱和脂肪酸是近年发现的新的脂肪酸合成途径。这种途径与常规的由脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延长酶引导的脂肪酸合成途径有着本质上的差别。总结了近些年细菌利用聚酮合成酶合成多不饱和脂肪酸这一新途径的研究状况，重点阐明其分子机制，并对其研究趋势及应用前景进行了展望。

细菌;聚酮合成酶;多不饱和脂肪酸

多不饱和脂肪酸是一类含有多个双键的脂肪酸。多不饱和脂肪酸不仅是细胞膜的重要组成，还是一系列具有重要生理活性功能产物的重要前体物质。长链多不饱和脂肪酸一般指含有20个以上碳原子的多不饱和脂肪酸，主要存在于一些海洋鱼类、真菌和藻类等真核生物中。上世纪80年代末，研究者发现原核生物中除蓝细菌以外，某些细菌也能合成n-3途径的长链多不饱和脂肪酸。并且这类细菌往往生活在比较特殊的环境中，如低温深海中和海洋鱼类的肠道中。尤其值得关注的是，这类细菌产生的不是常见的中长链多不饱和脂肪酸，如亚麻酸和亚油酸一类，而是稀有且具有高营养价值和生理活性的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)［1-3］。一般认为，多不饱和脂肪酸是在线粒体或内质网上通过一系列的脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase)催化的碳链脱饱和反应和由脂肪酸延长酶(fatty acid elongase)催化的延长反应而合成［4］。但近年来通过对产生DHA或EPA的一类海洋细菌进行研究后发现，除了这种常规合成途径外，还存在一种独特的不依赖于脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延长酶的新途径合成长链多不饱和脂肪酸［3，5-6］。在这一新途径中，均发现一种存在于细胞质中、由多亚基组成的复合酶聚酮合成酶(polyketide synthase，PKS)，该酶与脂肪酸去饱和酶几乎没有同源性，但与脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)有相似的保守结构域，因而该途径被称为聚酮合成酶途径(简称PKS途径)。本文从聚酮合成酶途径中关键基因的分子克隆与结构功能分析两方面阐述其研究现状，以期为相关研究提供参考。

1 PKS途径中关键功能基因的克隆和异源表达

1.1 PKS途径中关键功能基因的克隆及其类型

在1996年日本科学家首次报导了从海洋动物的肠道中新分离到一种能产生EPA的海洋细菌腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens SCRC2378)，该菌株中EPA含量占总脂肪酸含量的24%～40%，并且几乎没有检测到C18到C20之间的多不饱和脂肪酸，说明该菌株中存在非常特别的合成EPA机制。随后该研究小组从该菌株中克隆得到一段38 kbp的DNA片断，该片断含有8个大于1 kb的开发阅读框，然而只有其中的5个开放阅读框是合成EPA所必需的。这5个开放阅读框分别被命名为pfaA、pfaB、pfaC、pfaD和pfaE［3］。随后，研究者陆续从多个可以产生EPA或DHA的细菌中发现与pfa具有相似性的基因。Allen等［7］从深海发光杆菌(Photobacterium profundum SS9)中获得了大小为33 kbp编码EPA合成的基因簇pfaA、pfaB、pfaC、pfaD，但不包括编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferase，PPTase)的基因pfaE。Delong等［1］早在1986年就分离到1株可以产生DHA的海产弧菌(Vibrio marinus MP-1)，但直到1999年，Tanaka等［8］推测该菌株以PKS途径来合成DHA，并根据已测序的全基因组序列来设计引物，最终克隆得到包含pfaA、pfaB、pfaC和pfaD基因簇的40 kbp的DNA片段。作者分析由于没有克隆到pfaE，因而该基因簇一直未能在大肠埃希菌中成功表达。此外，在1株能产生EPA且嗜冷的希瓦氏菌(Shewanella sp.GA-22)中，虽然也发现了PKS合成途径，但仅克隆得到pfaA和pfaC 2个基因片断［9］。由于此扩增过程中用到的简并引物是根据腐败希瓦氏菌SCRC2378和深海发光杆菌SS9及海产弧菌MP-1中已报道的pfa序列来设计的，因此可能由于希瓦氏菌GA-22中pfaB、pfaD和pfaE基因与其他来源的基因同源性不高，而未能通过简并引物扩增的方法获得完整的pfa基因序列。

近年来，随着越来越多海洋细菌基因组测序的完成，人们发现无论是已报道能产生长链多不饱和脂肪酸的海洋细菌，或是推测能产生长链多不饱和脂肪酸的海洋细菌均含有类似于pfa系列的基因序列。根据pfa系列基因的排列方式，PKS合成途径的关键基因大致分为3种类型。第1种类型最重要的特征是同一基因簇中包括所有pfaA、pfaB、pfaC、pfaD和pfaE 5个关键基因，这种类型主要分布在奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR-1)、冷红科尔韦尔氏菌(Colwellia psychrerythraea34H)以及腐败希瓦氏菌SCRC2378为代表的海洋细菌中。尽管在腐败希瓦氏菌SCRC2378的pfa基因簇中pfaE与其他4个基因并非连续排列，而是间隔了2个似乎并不相关的开放阅读框，但该基因簇仍归于这一类型［3］。第2种类型与第1种类型的差异不大，也包括5个完整的pfa系列基因，但pfaE与前4个基因不在同一基因簇中，例如海产弧菌MP-1的pfaE与其余4个pfa系列基因不在同一基因簇中，但功能上还是体现互补性［8］。第3种类型在1株假交替单胞菌(Pseudoaltermonas sp.Strain DS-12)中被发现，pfa系列基因位于同一基因簇，但只包括pfaA、pfaB、pfaC和pfaD 4个基因，而pfaE整合到pfaC基因的序列中形成pfaC/E，执行双功能。此外，pfaB与pfaC/E之间还被一个功能不相关的开放阅读框所隔开(GenBank ABF00130)。

1.2 PKS途径中关键基因的异源表达

尽管越来越多海洋细菌中参与长链多不饱和脂肪酸合成的PKS途径关键基因被分析和克隆，但将这类基因在异源微生物中成功表达并获得最终产物EPA或DHA的范例并不多见。据推测造成这一困难主要有两点原因，一是由于完整的pfa基因簇一般都有30 kbp左右的大小，成功转化异源微生物的几率相对较小;二是目前已获得的完整的pfa基因簇并不多。日本一科研小组首次报道将来源于腐败希瓦氏菌SCRC2378中包含完整pfa基因簇的38 kbp片段转入1株原核光合细菌聚球藻中，获得了能够产生EPA的基因工程藻株。经过初步的发酵条件优化，该菌株可产生干重最高为0.64 mg/g的EPA［10］。随后，同样来自于腐败希瓦氏菌SCRC2378中38 kbp的片段还被分别转入大肠埃希菌JM109以及大肠埃希菌DH5α。不同培养条件下，重组大肠埃希菌产生EPA的含量可占总脂肪酸含量的6.3%～22%［3，11］。此外，来自于奥奈达希瓦氏菌MR-1的pfa基因簇被克隆并在大肠埃希菌中表达，重组细菌产生EPA的含量仅占到总脂肪酸含量的0.69%。但将该pfa基因簇放到含有lacZ启动子的多拷贝质粒pBluescript SK(+)中再转入大肠埃希菌，重组菌株EPA的含量提高到占总脂肪酸含量的7.5%［12-13］。将来自于另一株可以合成EPA的希瓦氏菌BR-2的pfa基因簇直接在大肠埃希菌XL-Blue MR中表达，就可检测到重组菌株EPA的含量占到总脂肪酸含量的7.5%［14］。目前所有的报道都是将pfa基因簇转入原核生物，并使之产生长链多不饱和脂肪酸。在今后的研究中，可以尝试将这类基因进行一定的修饰或改造后，转入模式真核生物如毕赤酵母、酿酒酵母以及拟南芥中，合成这类稀有的长链多不饱和脂肪酸。

2 PKS途径中关键基因的结构及其功能

2.1 PKS途径中关键基因的结构分析

从目前已报道的结果可以看出，pfa基因簇的存在是海洋细菌通过PKS途径合成EPA或DHA的必需条件。进一步对这类细菌中pfa基因簇进行分析发现，尽管pfa基因簇的基本框架结构相似，但某些结构域还是有许多独特之处。在第1类和第2类的pfa基因簇中，pfaA一般包括3-酮脂酰合成酶(3-ketoacyl synthase)、丙二酰辅酶A:酰基载体蛋白酰基转移酶(malonyl coenzyme A: acyl carrier protein acyltransferase)以及3-酮脂酰ACP还原酶(3-ketoacyl-ACP reductase)的典型结构域，因而被认为是编码一个多功能的蛋白。pfaC一般包括2个3-酮脂酰合成酶典型结构域的重复序列以及2～3个3-羟癸酰ACP脱水酶(3-hydroxydecanoyl-ACP dehydratases)典型结构域的重复序列。据报道，奥奈达希瓦氏菌MR-1、腐败希瓦氏菌SCRC2378和深海发光杆菌SS9中pfaC的第二个类似3-酮脂酰合成酶的编码区被证实是一种碳链延长因子［7，15-16］。值得注意的是，目前发现所有负责EPA合成的pfaC中均有3个类似于fabA的3-羟癸酰ACP脱水酶的典型结构域，而所有负责DHA合成的pfaC中均只有2个3-羟癸酰ACP脱水酶的典型结构域，而另外一个处于中间位置的结构域却和fabZ/A具有同源性。pfaB和pfaD编码的蛋白一般包括3-酮脂酰合成酶、酰基转移酶(acyltransferase)以及烯酰还原酶(enoyl reductase)的典型结构域［11，17］。目前仅在产生DHA的海产弧菌MP-1［18］和冷红科尔韦尔氏菌34H［18］中发现PfaB蛋白含有典型的3-酮脂酰合成酶结构域。海产弧菌MP-1的PfaB尽管含有典型的3-酮脂酰合成酶结构域，却惟独缺少一段包括活性位点在内的序列［19］。假交替单胞菌DS-12中pfa基因簇的结构比较独特，不同于以上任何一种情况。该菌株的PfaB蛋白具有2个3-酮脂酰合成酶的典型结构域，而PfaC/E蛋白同时具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和2个3-羟癸酰ACP脱水酶的结构域。并且，存在于pfaC/E基因下游的pfaD基因中，包含一段与烯酰还原酶(enoyl reductase)同源的序列［20］。

在pfa基因簇中，相对于pfaABCD基因而言，目前对pfaE的研究最为透彻。参与EPA或者DHA合成的pfaE基因，又称为磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因，一般被认为是一个大的基因家族。依据推测的蛋白质大小和核心区结构组成可将这个家族归为2种类型的Sfp型的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因家族。第1种具有P0、P1a和P1b 3个核心区，主要负责EPA和DHA的合成;第2种具有1A、P1a'和P1b'3个核心区，主要负责多聚酮和非核糖体肽的合成，且在结构上类似于第1种类型。例如，在基因组已经测序的深海发光杆菌SS9中，分析pfaE基因(GenBank: CAG23685)的结构属于典型的第1类Sfp型磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因。

2.2 PKS途径中关键基因的互补功能分析

目前，对以腐败希瓦氏菌SCRC2378为代表的合成EPA的细菌和以海产弧菌MP-1为代表的合成DHA的细菌研究较为清楚，因此大部分的研究是以这2株细菌为模型来分析PKS途径中pfa系列基因的互补功能。最初研究人员发现腐败希瓦氏菌SCRC2378中的pfaABCD 4个基因在大肠埃希菌中表达，重组菌株不能合成EPA，但将来自海产弧菌MP-1中861个碱基对组成的pfaE基因和来自腐败希瓦氏菌SCRC2378中的pfaABCD 4个基因在大肠埃希菌中共表达时，重组菌株产生了约占总脂肪酸成分12%的EPA。这一互补试验有力证实了pfaE基因编码的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶是PKS途径介导n-3类多不饱和脂肪酸合成的必需酶［15-16］。但将pfaA基因的活性中心突变后，再来重复以上互补实验，发现无论有无pfaE基因存在，重组菌株都不能合成EPA。以上实验说明pfaA基因的功能在EPA合成中也是必需的［16］。若将腐败希瓦氏菌SCRC2378中pfaBCDE 4个基因和海产弧菌MP-1中pfaABCD 4个基因共表达时，重组菌株既可以合成EPA又可以合成DHA［20］。

随后由于从深海发光杆菌SS9中未克隆得到pfaE基因，因此研究人员将来自于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和1株希瓦氏菌(Shewanella sp.SC2A)中的pfaE基因与深海发光杆菌SS9中的pfaABCD 4个基因在大肠埃希菌中共表达，但重组菌株未能合成EPA［8］。分析原因可能是由于枯草芽胞杆菌和希瓦氏菌SC2A中的pfaE基因均属于第2类的Sfp型磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因。近2 a，由于深海发光杆菌SS9的基因组测序完成，已有研究人员从该菌株中克隆得到全长为690 bp的pfaE基因，并与海产弧菌MP-1中的pfaABCD 4个基因在大肠埃希菌中共表达，最终也实现了重组菌株合成DHA，并且DHA的含量占到总脂肪酸含量的2%［21］。深海发光杆菌SS9中pfaE基因则属于典型的第1类Sfp型磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因。

最近，日本北海道大学的学者又在研究PKS途径关键基因的功能方面取得了突破性进展。他们将来源于海产弧菌MP-1中负责合成DHA的 pfaABCDE 5个基因与来源于腐败希瓦氏菌SCRC2378中负责合成EPA的单独的pfaA、pfaB、pfaC、pfaD和pfaE 5个基因分别连接并在大肠埃希菌中进行共表达。结果发现，只有当来源于海产弧菌MP-1中pfaABCDE 5个基因与来源于腐败希瓦氏菌SCRC2378中的pfaB共表达时，重组菌株可以同时合成EPA和DHA。而海产弧菌MP-1中pfaABCDE 5个基因与腐败希瓦氏菌SCRC2378中其他基因共表达时，重组菌株都不能同时合成EPA和DHA。该实验说明pfaB是产生EPA最为关键的基因。在此基础上，他们还设计了一个有趣的实验，将来源于腐败希瓦氏菌SCRC2378的pfaABCDE 5个基因与海产弧菌MP-1中的pfaB在大肠埃希菌中共表达，结果重组菌株仅能产生EPA;而若将来源于腐败希瓦氏菌SCRC2378的pfaACDE 4个基因与海产弧菌MP-1中的pfaB在大肠埃希菌中共表达时发现，重组菌株不仅能产生EPA还能产生DHA［22］。由此推测，负责EPA合成的pfaB基因比负责DHA合成的pfaB基因合成效率更高，又或者在EPA和DHA合成过程中，Pfa蛋白复合物存在特定的底物竞争机制。但无论是哪种可能，都不能否认pfaB基因是决定PKS途径合成终产物十分关键的基因。

3 PKS途径研究展望

EPA和DHA这一类具有重要生理活性功能的稀有多不饱和脂肪酸主要来源于海洋鱼类。但由于环境污染对鱼类的毒害以及海洋鱼类产量的不稳定等因素，造成EPA和DHA这类多不饱和脂肪酸产量有限因而价格昂贵［23］。通过PKS途径合成EPA或DHA，相对于传统的脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延长酶合成途径而言，具有以下优势:首先，经由PKS途径合成的多不饱和脂肪酸具有高度的单一性，如腐败希瓦氏菌SCRC2378、冰海希瓦氏菌(Shewanella gelidimarina ACAM456T)等仅合成EPA而不合成DHA，而海产弧菌MP-1等细菌仅合成DHA而不合成EPA。少数例外，如从海洋鱼类肠道中分离到的1株未鉴定种属的细菌SCRC-21406、细菌16C1以及弧菌属的1株细菌T3615［3，24］可同时产生EPA和DHA，但往往DHA的含量(约占总脂肪酸含量的5%)远高于EPA的含量(约占总脂肪酸含量的1%)。至目前为止，尚未发现PKS代谢途径除EPA和DHA以外的长链脂肪酸等前体物或中间产物出现，而经由真核生物中常规途径合成的多不饱和脂肪酸不仅有终产物还有多种前体物质存在。其次，PKS途径合成多不饱和脂肪酸的过程不依赖于氧分子的存在。无论在有氧条件还是厌氧条件下，这类细菌都可以通过此途径来完成多不饱和脂肪酸的合成过程;与此不同，真核生物只能在有氧条件下通过常规途径来合成各类多不饱和脂肪酸。最后，经由PKS途径合成的多不饱和脂肪酸需要更少的还原能量，如NADPH。尽管细菌通过PKS途径合成多不饱和脂肪酸有以上优点，但同时也有一定的局限性。绝大部分利用PKS途径来合成多不饱和脂肪酸的细菌都是从海水中或海洋生物中分离得到的海洋细菌。因此，这类细菌几乎都在低温条件下生存，并且也只能在较低的温度下合成多不饱和脂肪酸。温度一旦超过一定范围，虽然有些细菌仍可以生长，但已不再合成多不饱和脂肪酸。另外，这类细菌往往是嗜盐菌。有研究者发现这类细菌主要分布在6个属中，这其中仅2株细菌冷海希瓦氏菌(Shewanella frigidimarina)和日本希瓦氏菌(Shewanella japonica)不嗜盐，但这2株菌仍然在一定浓度的NaCl存在条件下生长较好［25］。这一现象提示，今后可利用遗传修饰或定向进化等手段来改变这类细菌合成多不饱和脂肪酸的反应条件，如构建耐高温或耐低盐浓度的工程菌株，使其更适合于应用研究。

迄今为止，研究者们已逐步深入了解以海洋细菌为代表的原核生物如何通过PKS途径来合成EPA和DHA这类多不饱和脂肪酸，但具体机制方面仍有许多不解之谜。譬如，海洋细菌都是通过pfaABCDE基因簇这一固定模式来合成EPA或DHA，并且不同来源的pfaABCDE基因之间也具有很高的相似性，但最终合成的多不饱和脂肪酸却不一样，说明一定还存在某种未知机制来决定最终的产物合成。依据已有的研究结果，推测可能是Pfa系列蛋白的相互作用来影响最终产物的合成，但这一推测还需更多的实验来证实。此外，研究者们发现一种细胞内中链脂肪酸合成的抑制剂浅蓝菌素可以促进许多海洋细菌中EPA和DHA的合成［7，26］。目前已经证实脂肪酸合成基因簇(fab)是参与细胞内18碳以内中链脂肪酸合成的关键基因［19］。因此，下一步的研究方向可以利用已经建立的PKS途径pfaABCDE基因簇以及fab基因簇的体外重组体系来研究海洋细菌中PKS途径与中链常规脂肪酸合成途径间的相关系。

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Advanced in Biosynthesis of Polyunsaturated Fatty Acids by Bacterial Polyketide Synthase Pathway

WAN Xia1，2，JIANG Mu-lan1，2
(1.Oil Crops Res.Inst.of Chn.Acad.of Agric.Sci.，Wuhan 430062;2.Key Lab.for Biol.Sci.of Oil Crops，Minist of Agric.，Wuhan 430062)

Biosynthesis of polyunsaturated fatty acids(PUFAs)in bacteria by polyketide synthase pathway is a newly found way recently.This pathway is fundamentally distinct from previously recognized conventional pathway that needs fatty acid desaturases and elongases of saturated fatty acids.Some research advances on biosynthesis of PUFAs in bacteria by polyketide synthase pathway was summarized in this paper and emphasized on research situation in the molecular mechanism of this pathway，in addition，the research trends in this field and application prospect of this pathway was also speculated on.

bacteria;polyketide synthase;polyunsaturated fatty acids

Q939.1

A

1005－7021(2011)01－0068－06

国家自然科学基金(3100078);农业部油料作物生物学重点开放实验室开放课题(201012);

国家公益性科研院所专项资金(200903)

万霞女，助理研究员，博士。研究方向为微生物油脂和多不饱和脂肪酸代谢工程。E-mail:melaninwx@yahoo.com.cn

*通讯作者。Tel:027-86838791，E-mail:mljiang@oilcrops.cn

2010-12-20;

2011-01-20